重癥肌無(wú)力抗乙酰膽堿受體單鏈抗體A7酵母表達(dá)的特性鑒定.pdf

1、目的：測(cè)定畢赤酵母GS115表達(dá)的重癥肌無(wú)力單鏈抗體A7的一般特性，確定其分子量，以及與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的結(jié)合特異性。
　　方法：將攜帶有重組基因表達(dá)載體的畢赤酵母GS115復(fù)蘇后，利用抗生素G-418篩選高拷貝重組子，用YPD培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，再經(jīng)BMGY、BMMY表達(dá)培養(yǎng)基培養(yǎng)3天，每24小時(shí)添加100％甲醇使甲醇終濃度為1%誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)基上清液室溫經(jīng)14000 g離心后，利用斑點(diǎn)雜交試驗(yàn)初步判定上清液中的目的蛋白；采用

2、十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白印跡試驗(yàn)，檢測(cè)已經(jīng)轉(zhuǎn)化至畢赤酵母 GS115中的重癥肌無(wú)力重組載體 pPIC9K-ScFvA7表達(dá)的單鏈抗體 A7蛋白的分子量，應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)確定表達(dá)蛋白與大鼠肋間肌乙酰膽堿受體的親和性。
　　結(jié)果：畢赤酵母GS115培養(yǎng)上清液中有目的蛋白的表達(dá)，分子量約為44 KD，間接免疫熒光試驗(yàn)顯示在大鼠肋間肌細(xì)胞間有熒光出現(xiàn)。
　　結(jié)論：?jiǎn)捂溈贵wA7已經(jīng)成功地在畢赤酵母中表達(dá)，并且能與大