Wnt信號(hào)通路在壓力調(diào)控BMSCs-PRF雙膜共培養(yǎng)體系成軟骨響應(yīng)中作用的研究.pdf

1、良好的彈性及較低的摩擦性能是關(guān)節(jié)軟骨的主要力學(xué)特性,因此它在關(guān)節(jié)的功能活動(dòng)中極其重要。在人類和哺乳動(dòng)物中,關(guān)節(jié)的損傷是極其常見的,由于關(guān)節(jié)軟骨缺乏直接血管供應(yīng)及神經(jīng)支配,其損傷后難以自行修復(fù)。因此,需要我們?nèi)フ业揭环N可行方法來(lái)治療損傷后的軟骨。臨床上用于軟骨修復(fù)的方法較多,但都有一定的不足,組織工程軟骨的出現(xiàn)為軟骨再生提供了新的治療方法。組織工程軟骨的構(gòu)建需要三大基石:即種子細(xì)胞、支架材料和生長(zhǎng)因子。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)因其來(lái)

2、源廣泛、易于培養(yǎng)且具有多向分化潛能而成為組織工程技術(shù)中重要的種子細(xì)胞,用其作為種子細(xì)胞來(lái)進(jìn)行組織工程軟骨的構(gòu)建已成為現(xiàn)實(shí)。生長(zhǎng)因子能夠誘導(dǎo)組織工程軟骨種子細(xì)胞向軟骨方向分化,并且能夠促進(jìn)種子細(xì)胞的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)因子主要包括:胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-likegrowthfactors,IGF-1),成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforminggrowthfact

3、or-β,TGF-β)等,而富血小板纖維蛋白(platelet-richfibrin,PRF)因其含有多種天然比例的復(fù)合生長(zhǎng)因子、取材方便、制備簡(jiǎn)單、無(wú)免疫排斥等優(yōu)點(diǎn)正被先后用于組織缺損的修復(fù),本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PRF能夠緩慢釋放多種生長(zhǎng)因子,并成功的利用PRF與細(xì)胞膜片復(fù)合構(gòu)建組織工程軟骨用于修復(fù)缺損的軟骨組織,取得了很好的修復(fù)效果。組織工程軟骨的構(gòu)建除了需要種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子及支架材料以外還取決于生物化學(xué)和力學(xué)效應(yīng)的共同作用,文獻(xiàn)

4、報(bào)道力學(xué)刺激能夠增強(qiáng)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的能力,但其機(jī)制不明。本系列研究前期發(fā)現(xiàn)120KPa、1h/d、連續(xù)4d的靜態(tài)液壓加載能夠顯著促進(jìn)BMSCs向軟骨方向分化,但是關(guān)于BMSCs/PRF共培養(yǎng)體系在力學(xué)作用下成軟骨的分子機(jī)制目前還在探索研究之中。Wnt信號(hào)通路包括經(jīng)典Wnt信號(hào)通路與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,非經(jīng)典和經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路在細(xì)胞向軟骨分化的過(guò)程起著重要的作用。研究表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路在阻止軟骨的分化,

5、加強(qiáng)軟骨的成骨和推動(dòng)軟骨的成熟中是有意義的,而非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路通過(guò)Wnt5a的介導(dǎo)作用推動(dòng)軟骨的分化,推遲軟骨從成熟到肥大的階段。然而Wnt信號(hào)通路是否參與BMSCs在力學(xué)刺激成軟骨的過(guò)程我們尚不清楚,壓力與PRF是否對(duì)Wnt信號(hào)通路有作用我們還不是很明確,以及經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在成軟骨之間的關(guān)系還沒(méi)有見到相關(guān)報(bào)道。因此,本研究將采用WesternBlot、Real-timePCR方法深入探討Wnt信號(hào)通路在壓力促BMSC

6、s細(xì)胞膜片及BMSCs/PRF雙膜共培養(yǎng)體系向成軟骨方向分化中扮演的角色,以及經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在壓力促BMSCs成軟骨過(guò)程中各自所起的作用及其相互關(guān)系
　　本實(shí)驗(yàn)共分為四個(gè)部分:
　　實(shí)驗(yàn)一,我們選用4月齡新西蘭大白兔,在其髂骨處抽取骨髓,采用密度梯度離心法獲取BMSCs,培養(yǎng)至P3代,經(jīng)表面標(biāo)記物的鑒定及成脂成骨誘導(dǎo)后證明所得到的細(xì)胞是具有多向分化潛能的BMSCs;經(jīng)膜片誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后制得BMSCs細(xì)胞膜片,在同體

7、兔耳緣中動(dòng)脈抽取10ml動(dòng)脈血,經(jīng)3000r/min快速離心10min后制得PRF,將PRF壓制成膜后置于BMSCs膜片上制成雙膜共培養(yǎng)體。
　　實(shí)驗(yàn)二,我們選用課題組前期篩選出的能夠顯著促進(jìn)BMSCs體內(nèi)外成軟骨效應(yīng)的120KPa靜態(tài)壓力作用于單獨(dú)培養(yǎng)或與PRF共培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞膜片,通過(guò)WesternBlot方法觀察0-60min中壓力作用于單獨(dú)培養(yǎng)或與PRF共培養(yǎng)的BMSCs細(xì)胞膜片后經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通

8、路與非經(jīng)典Wnt/ca2+信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果顯示,當(dāng)120KPa的壓力作用于單獨(dú)BMSCs膜片15min后激活BMSCs中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路p-GSK3β蛋白的表達(dá),30min時(shí)激活BMSCs中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路中β-catenin蛋白的表達(dá),60min時(shí)兩種蛋白的表達(dá)量達(dá)到最大。當(dāng)120KPa的壓力作用于與PRF共培養(yǎng)的BMSCs膜片時(shí),經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表

9、達(dá)未發(fā)生明顯的變化。當(dāng)120KPa的壓力作用于單獨(dú)BMSCs膜片30min后激活BMSCs中非經(jīng)典的Wnt/Ca2+信號(hào)通路,且在60min非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量最大,當(dāng)120KPa的壓力作用于與PRF共培養(yǎng)的BMSCs膜片時(shí)非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量提高;說(shuō)明120KPa的壓力能夠激活單獨(dú)或與PRF共培養(yǎng)的BMSCs膜片中經(jīng)典與非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路;且與PRF共培養(yǎng)的BMSCs膜片中非經(jīng)典Wnt信號(hào)

10、通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量高于單獨(dú)的BMSCs膜片。
　　實(shí)驗(yàn)三,觀察經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路與非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路在成軟骨中的作用。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939選1μM、2μM、4μM三個(gè)濃度,非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路抑制劑L-690,330選用20μM、50μM、100μM三個(gè)濃度,經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑XAV939在壓力作用前16h加入膜片培養(yǎng)液中,非

11、經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路抑制劑L-690,330在壓力作用前5d加入膜片培養(yǎng)液中,120KPa作用60min后提取BMSCs膜片中的蛋白與mRNA,WesternBlot方法檢測(cè)經(jīng)典與非經(jīng)典信號(hào)通路的特異性指標(biāo)的表達(dá),以確定不同抑制劑濃度對(duì)兩條信號(hào)通路的抑制作用;Real-timePCR檢測(cè)PCNA基因的表達(dá)以監(jiān)測(cè)不同濃度抑制劑對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。結(jié)果表明2μMXAV939可顯著抑制細(xì)胞膜片中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,且不影響細(xì)胞的增殖

12、活性;50μML-690,330可顯著抑制細(xì)胞膜片中非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路,且不影響細(xì)胞的增殖活性。將實(shí)驗(yàn)二所篩選的最適壓力條件(120KPa、60min)作為該細(xì)胞力學(xué)刺激條件,利用實(shí)驗(yàn)三篩選的抑制劑濃度將實(shí)驗(yàn)分為4組:BMSCs/PRF雙膜共培養(yǎng)組,BMSCs/PRF雙膜共培養(yǎng)+壓力刺激組,Wnt/β-catenin信號(hào)通路或Wnt/ca2+信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理的BMSCs/PRF雙膜共培養(yǎng)組,Wnt/β-catenin信號(hào)通路或Wn

13、t/ca2+信號(hào)通路抑制劑預(yù)處理的BMSCs/PRF雙膜共培養(yǎng)+壓力刺激組,WesternBlot方法及Real-timePCR方法檢測(cè)非經(jīng)典Wnt/Ca2+通路及經(jīng)典Wnt/β-catenin通路信號(hào)分子與特異性成軟骨指標(biāo)的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在加入2μM的XAV939抑制劑后軟骨相關(guān)指標(biāo)Sox-9、Aggrecan及Ⅱ型膠原(collagentypetwo,Col-Ⅱ)的蛋白水平及基因表達(dá)降低,說(shuō)明經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路正

14、向調(diào)控壓力促BMSCs/PRF雙膜共培養(yǎng)體系中干細(xì)胞的軟骨向分化過(guò)程;加入50μM的L-690,330抑制劑后軟骨相關(guān)指標(biāo)Sox-9、Aggrecan及Ⅱ型膠原的蛋白水平及基因表達(dá)升高,說(shuō)明非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路也參與了壓力促BMSCs/PRF雙膜共培養(yǎng)體中干細(xì)胞的軟骨向分化的過(guò)程,但起著負(fù)向調(diào)控作用。
　　實(shí)驗(yàn)四,觀察經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路與非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路兩者之間的相互關(guān)系。我們通過(guò)在BM

15、SCs細(xì)胞膜片中加入2μM經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制劑XVA939并經(jīng)120KPa的靜態(tài)液壓力學(xué)加載裝置作用60min后,WesternBlot方法檢測(cè)非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路分子活化情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該信號(hào)通路中CaMKⅡ與PKC活化明顯增強(qiáng),同理,當(dāng)我們加入非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路抑制劑后來(lái)觀察經(jīng)典Wnt/β-catenin通路分子活化情況,發(fā)現(xiàn)β-catenin信號(hào)分子表達(dá)增強(qiáng),說(shuō)明在壓力促BMSCs/PRF共培養(yǎng)體系中干細(xì)

16、胞成軟骨向分化過(guò)程中經(jīng)典與非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路之間存在相互抑制關(guān)系。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:無(wú)論BMSCs膜片單獨(dú)培養(yǎng)或與PRF共培養(yǎng)狀態(tài)下,120KPa、60min的靜態(tài)液壓均能夠有效激活BMSCs中的Wnt/β-catenin信號(hào)通路與非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路,其中與PRF共培養(yǎng)時(shí)壓力對(duì)BMSCs中非經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路的激活作用更加明顯,但PRF存在與否對(duì)壓力激活BMSCs中經(jīng)典Wnt信號(hào)通路分子的效應(yīng)不產(chǎn)生明顯影響。2μMX

17、AV939濃度可明顯抑制BMSCs膜片中的經(jīng)典Wnt信號(hào)通路分子的表達(dá)且不影響細(xì)胞的增殖活性、50μML-690,330則能有效抑制BMSCs細(xì)胞膜片中的非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路且不影響細(xì)胞的增殖活性。進(jìn)而采用逆向阻斷的方法發(fā)現(xiàn),經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與了壓力促BMSCs軟骨向分化的過(guò)程并且起到正向調(diào)控作用,而非經(jīng)典Wnt/Ca2+信號(hào)通路也參與了壓力促BMSCs軟骨向分化的過(guò)程但起到負(fù)向調(diào)控作用。并且本研究證實(shí)經(jīng)典的W