P38MAPK-NF-κB信號(hào)在壓力調(diào)控BMSCs-PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)中作用的研究.pdf

1、隨著關(guān)節(jié)軟骨損傷發(fā)生率的增加,如何修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨成為了困擾臨床治療的難題,近些年來(lái)組織工程軟骨的出現(xiàn)為軟骨缺損的修復(fù)帶來(lái)了新的希望。組織工程軟骨包括四大因素,即種子細(xì)胞、支架材料、生長(zhǎng)因子及生物反應(yīng)器。但是如何將這些因素整合成為一體,如何將它們制作成形并應(yīng)用于臨床成為了研究人員試圖解決的問題。
　　骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)來(lái)源廣泛,能在一定的力學(xué)環(huán)境下向軟骨

2、細(xì)胞方向分化,可以作為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的種子細(xì)胞,而細(xì)胞膜片技術(shù)可將所需種子細(xì)胞塑形,這就能夠最大限度的獲得移植細(xì)胞。富血小板纖維蛋白(plaletet-rich fibrin,PRF)作為一種富含血小板及白細(xì)胞的生物支架材料,不僅可以為種子細(xì)胞釋放轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)-β1、血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor,PDGF)-AB及血管內(nèi)

3、皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等多種細(xì)胞因子,還具有較好地促進(jìn)組織再生的能力。本課題組前期采用發(fā)明專利技術(shù)將PRF膜片與BMSCs細(xì)胞膜片復(fù)合后構(gòu)建成BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體移植材料,另外,我們還發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體能夠在適宜的壓力條件下向成軟骨方向分化,但是相關(guān)的機(jī)理不明。P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinases,P3

4、8MAPK)是一種分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)且具有絲氨酸及酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶,它可被多種刺激因子激活,并參與細(xì)胞的形成、生長(zhǎng)、分化等多種生理過(guò)程。有研究證明P38MAPK參與了力學(xué)刺激BMSCs成軟骨過(guò)程,但是它是否參與力學(xué)刺激BMSCs細(xì)胞膜片中成軟骨響應(yīng)目前尚不清楚。NF-κB信號(hào)通路是細(xì)胞核內(nèi)重要的信號(hào)通路,它同樣能被多種刺激因子激活并參與細(xì)胞的多種生理反應(yīng)。但是它是否參與軟骨形成的過(guò)程并不明確,其與P38MAPK在力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)

5、程中的上下游關(guān)系目前也存在爭(zhēng)議。因此,本研究從分子生物學(xué)角度出發(fā),研究壓力刺激兔BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體后P38MAPK和NF-κB信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá),探討P38MAPK和NF-κB信號(hào)通路在壓力調(diào)控兔BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)過(guò)程中的具體作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　本實(shí)驗(yàn)共分為四個(gè)部分:
　　實(shí)驗(yàn)一中,我們從新西蘭大白兔股骨處抽取骨髓,利用密度梯度離心法分離純化兔BMSCs,經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)擴(kuò)增后,成骨成脂誘導(dǎo)

6、分化及流式細(xì)胞術(shù)鑒定我們提取的細(xì)胞是BMSCs。
　　實(shí)驗(yàn)二與實(shí)驗(yàn)三中,抽取兔耳中央動(dòng)脈血液10ml,以3000r/min離心10min獲取PRF凝膠,并用無(wú)菌紗布包裹擠壓制取PRF膜片。按照本課題組前期探索成功并申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利的技術(shù):一種干細(xì)胞膜片片段復(fù)合富血小板纖維蛋白膜雙膜復(fù)合體移植材料的制備方法,將自體BMSCs膜片與自體PRF復(fù)合形成BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體,采用課題組自行研發(fā)制作的細(xì)胞液壓加載裝置,根據(jù)本課題組前

7、期篩選出的對(duì)體外培養(yǎng)BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體能夠產(chǎn)生良好促軟骨向分化效應(yīng)的生物力學(xué)刺激條件:120KPa、1h/d、連續(xù)4d靜態(tài)液壓加載。我們利用Westernblot技術(shù),檢測(cè)120KPa不同時(shí)間點(diǎn)作用于BMSCs細(xì)胞膜片及BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體中P38MAPK和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　(1)單純PRF作用于兔BMSCs細(xì)胞膜片誘導(dǎo)0-120min,P38MAPK和NF-κB信號(hào)均未

8、被激活。
　　(2)120KPa壓力作用于BMSCs細(xì)胞膜片或BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體15min后,P38MAPK磷酸化水平升高,而NF-κB信號(hào)通路中漿蛋白IκBα、p-IκBα(磷酸化IκBα)和p-p65(磷酸化p65)及核蛋白中p65的表達(dá)量未出現(xiàn)明顯變化,這說(shuō)明壓力刺激15min時(shí)只激活了P38MAPK通路;第30min時(shí),NF-κB信號(hào)通路中漿蛋白IκBα下調(diào)、p-IκBα和p-p65上調(diào)及核蛋白中p65也同時(shí)上調(diào)

9、,這說(shuō)明壓力刺激30min時(shí)細(xì)胞核內(nèi)的NF-κB信號(hào)通路被激活;隨后我們進(jìn)行持續(xù)加壓,發(fā)現(xiàn)在第60min時(shí)P38MAPK和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子蛋白表達(dá)量最高,而60min以后,這兩條通路表達(dá)量逐漸恢復(fù)正常。
　　實(shí)驗(yàn)四中,根據(jù)P38MAPK和NF-κB信號(hào)通路相關(guān)分子最高蛋白表達(dá)量,我們選取120KPa,加壓60min的實(shí)驗(yàn)條件,再利用抑制劑法探討力學(xué)刺激BMSCs細(xì)胞膜片及BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體中P38MAPK和NF

10、-κB信號(hào)通路之間的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)P38MAPK抑制劑SB203580在抑制P38MAPK信號(hào)的同時(shí)也抑制了NF-κB信號(hào)通路,而NF-κB抑制劑PDTC在抑制了NF-κB信號(hào)的同時(shí)并未抑制P38MAPK信號(hào)通路,這意味著P38MAPK可能是NF-κB的上游信號(hào)分子。采用Realtime-PCR和Western blot技術(shù)對(duì)P38MAPK/NF-κB信號(hào)通路在壓力調(diào)控BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)中的作用進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示:B

11、MSCs細(xì)胞膜片及兔BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體在給予120KPa加壓60min時(shí),軟骨細(xì)胞特異性指標(biāo)Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ的蛋白水平及基因表達(dá)升高;給予P38MAPK抑制劑SB203580或NF-κB抑制劑PDTC后Sox-9、Aggrecan及Col-Ⅱ的蛋白及基因表達(dá)水平降低。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論:課題組前期所證明的促BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨響應(yīng)的生物力刺激條件為120Kpa、1h/d、連續(xù)4d的靜態(tài)液

12、壓加載,且BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體組效果優(yōu)于BMSCs細(xì)胞膜片組。進(jìn)一步分析單次120KPa持續(xù)60min的靜壓加載下,BMSCs細(xì)胞膜片或兔BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體中P38MAPK和NF-κB信號(hào)通路信號(hào)分子表達(dá)最強(qiáng),其成軟骨蛋白及基因指標(biāo)同時(shí)上升,但是PRF并不能激活BMSCs細(xì)胞膜片中P38MAPK和NF-κB信號(hào)通路。當(dāng)阻斷P38MAPK或NF-κB信號(hào)通路后,兔BMSCs細(xì)胞膜片及BMSCs/PRF雙膜復(fù)合體成軟骨方向