BMPs信號通路在壓力調控BMSCs-PRF雙膜復合體成軟骨響應中作用的研究.pdf

1、軟骨的畸形、缺損是臨床常見疾病之一,由于不含神經、血管等組織,軟骨再生能力極差,怎樣修復軟骨組織缺損一直以來是臨床難以解決的問題。目前,組織工程技術的出現有望解決這一難題,通過選擇適當的種子細胞、生長因子、支架材料及適宜的生長環(huán)境,利用軟骨組織工程技術已在體內外構建出具有一定形態(tài)的軟骨組織,并有臨床可行性。骨髓間充質干細胞(Bone Marrow Mesenchymal Stemcells,BMSCs)具有很強的增殖能力及多向分化潛能,

2、可在一定的環(huán)境下誘導分化為軟骨細胞,可作為種子細胞廣泛應用于軟骨再生修復。富血小板纖維蛋白(Platelet-richfibrin,PRF)作為一種富含血小板和白細胞的生物材料,含有多種生長因子的同時為細胞的遷移、黏附提供了場所。本課題組前期采用我們的專利技術將PRF膜片與BMSCs膜片復合后,成功構建BMSCs/PRF雙膜復合體移植材料,并證實該復合體在適宜的體內外環(huán)境中可以成功生成組織工程軟骨進而在軟骨再生與修復中具有良好的應用前景

3、。另外,由于關節(jié)軟骨在體內不可避免地要受到生物力刺激,力學刺激影響軟骨細胞的代謝與生長因子分泌,并在關節(jié)軟骨的生長、發(fā)育以及結構與功能維持的過程中起重要的作用,一旦軟骨組織工程種子細胞在體外培養(yǎng)時缺乏有效的生物力刺激,會導致所生成的軟骨組織細胞排列不規(guī)則、軟骨基質含量少,并且所含的膠原纖維較細,所構建的組織工程軟骨力學性能也就較差且形態(tài)不佳,無法達到成功修復關節(jié)軟骨缺損的目的。因而,本課題組前期通過對PCNA、Sox-9、Aggreca

4、n、Col-Ⅱ基因表達水平的檢測,已篩選出適當的力學刺激加載方式,即120KPa、1h/d、連續(xù)4d的靜態(tài)液壓加載,當該力學刺激作用于BMSCs/PRF雙膜復合體后,在體外可顯著地促BMSCs成軟骨分化;并通過裸鼠皮下以及關節(jié)軟骨缺損區(qū)移植證明,該力學刺激的預調可以明顯促進BMSCs/PRF雙膜復合體的體內成軟骨能力。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMPs)是從骨基質中分離得到的一類酸性糖蛋白,能

5、高效誘導骨及軟骨組織的發(fā)生,BMPs不僅是有效的促軟骨分化因子同時也是敏感的力學信號轉導分子,BMPs信號通路在軟骨形成過程中有著重要的作用。那么,在本研究前期所觀察到的壓力促BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨分化的過程中,BMPs信號是否參與了力學信號的轉導?BMPs信號與壓力促BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨響應有著怎樣的關系呢?本實驗即通過構建BMSCs/PRF雙膜復合體,繼而模擬體內受力環(huán)境,從分子學角度出發(fā),觀察壓力刺激兔B

6、MSCs/PRF雙膜復合體后BMPs信號相關分子的表達,探討B(tài)MPs在壓力調控兔BMSCs/PRF成軟骨響應過程中的具體作用及其信號途徑,以期待從BMPs信號角度揭示壓力刺激BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨效應中的力學信號轉導機制。
　　本研究分為三個部分:
　　第一部分:利用骨髓穿刺法抽取兔骨髓血,通過密度梯度離心法分離、培養(yǎng)兔BMSCs并行形態(tài)學觀察至P3代,經流式細胞術鑒定和多向分化誘導實驗(成骨分化和成脂分化),確

7、定本實驗所培養(yǎng)的兔BMSCs具有組織工程種子細胞的特點。將BMSCs培養(yǎng)至P3代,通過膜片誘導液誘導10-14d后,成功構建出細胞膜片結構;抽取自體兔耳中央動脈血10ml,以3000r/min離心10min、靜置10-15min,獲取PRF凝膠,擠出多余液體后可獲PRF膜片結構;按照本課題組前期申請的國家發(fā)明專利(實質審查階段):一種干細胞膜片片段復合富血小板纖維蛋白膜雙膜復合體移植材料的制備方法,將自體BMSCs膜片與自體PRF復合形

8、成BMSCs/PRF雙膜復合體。
　　第二部分:BMSCs/PRF雙膜復合體采用課題組自行研發(fā)制作的細胞液壓加載裝置,按照前期篩選出的對體外培養(yǎng)BMSCs/PRF雙膜復合體能夠產生良好促軟骨分化效應的生物力學刺激條件:120KPa、1h/d、連續(xù)4d靜態(tài)液壓分別對BMSCs和BMSCs/PRF雙膜復合體進行加載,無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復合體和BMSCs膜片在常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)4d,通過Real-timePCR和Weste

9、rnBlot技術,檢測BMPs信號通路相關分子基因和蛋白情況的表達。結果顯示:120KPa、1h/d、連續(xù)4d的力學刺激無論是作用于BMSCs還是BMSCs/PRF雙膜復合體后,BMP2、BMP受體(BMPRⅠB、BMPR2)以及Smad1、Smad5的基因及蛋白水平均上調;而無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復合體常規(guī)培養(yǎng)4d后,BMPs相關分子表達無明顯上調。提示,在適當的生物力學作用下,BMPs信號相關分子可以感應到力學信號的刺

10、激,而將信號傳遞至胞內發(fā)揮其相應的作用,BMPs信號通路參與了壓力促BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨響應過程。
　　第三部分:為了探索在單次加載過程中,BMPs信號分子激活的時效性,對BMSCs和BMSCs/PRF雙膜復合體給予120KPa持續(xù)加載120min,無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復合體和BMSCs膜片在常規(guī)培養(yǎng)液中培養(yǎng)120min,分別在0、30、60、90、120min五個時間點,通過Real-time PC

11、R和Western Blot檢測BMPs相關分子基因和蛋白的表達。結果顯示:無論是BMSCs還是BMSCs/PRF雙膜復合體,在120min持續(xù)壓力加載過程中,60min時BMP2及BMPs信號通路相關分子基因和蛋白的表達均最佳,無壓力刺激時,BMSCs/PRF雙膜復合體常規(guī)培養(yǎng),不同時間點檢測BMPs信號通路相關分子表達均無明顯差異。提示:在120min的持續(xù)加載過程中,60min時BMPs信號通路相關分子表達最佳,從分子角度證明了實

12、驗前期篩選的持續(xù)性加載1h時長的可行性,并且進一步說明BMPs信號是壓力調控BMSCs/PRF雙膜復合體產生效應的重要分子機制之一,而單純富含復合生長因子的PRF作用并不能有效激活BMSCs中的BMPs信號通路。
　　通過WesternBlot技術,對BMPs信號在壓力調控兔BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨響應中的作用進行研究。結果顯示兔BMSCs/PRF雙膜復合體在給予單次60min、120KPa持續(xù)壓力加載時,軟骨細胞特有的

13、細胞外基質Ⅱ型膠原(Collagen type two,Col-Ⅱ)、蛋白多糖(Aggrecan)的蛋白表達升高;加入外源性BMPs抑制劑Noggin后,相同力學刺激后Col-II和Aggrecan表達的下調。提示壓力促進BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨響應中BMPs信號通路有著重要的作用。
　　實驗結論:在課題組前期證明的促BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨響應的生物力刺激條件(120KPa、1h/d、連續(xù)4d的靜態(tài)液壓加載)

14、作用下,BMSCs/PRF雙膜復合體中BMPs信號通路相關分子BMP2、BMP受體(BMPRⅠB、BMPR2)及Smad1、Smad5表達均明顯上調,而無壓力刺激的靜態(tài)BMSCs/PRF雙膜復合體培養(yǎng)組并未見到BMPs信號通路的激活,說明BMPs信號通路參與了壓力促BMSCs/PRF雙膜復合體成軟骨過程中的力學信號傳導;進一步分析單次壓力加載中BMPs活化的時間效應,發(fā)現:120min的持續(xù)加載過程中,120KPa持續(xù)60min時BMP