人嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體Msp2、Ats-1蛋白與宿主細(xì)胞潛在蛋白互作研究.pdf

1、人粒細(xì)胞無(wú)形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)是一種新發(fā)蜱傳人獸共患傳染病,發(fā)病病原嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體(Anaplasma phagocytophilum)是一種專性胞內(nèi)寄生菌,革蘭氏陰性,可寄居于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,也可生活在硬蜱中并傳播。人粒細(xì)胞是嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體生存、繁殖的重要場(chǎng)所。HGA臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、頭痛、肌痛、白細(xì)胞減少和血小板減少、肝酶活性水平升高等,與某些病毒性傳染病極其相似,極易發(fā)

2、生誤診,重癥者可引起死亡。家畜(馬、犬和反芻動(dòng)物)粒細(xì)胞無(wú)形體病臨床癥狀跟HGA基本相似。嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體經(jīng)蜱叮咬進(jìn)入機(jī)體后主要存在于粒細(xì)胞中,形成含菌包涵體,且不會(huì)被溶酶體融合,擾亂宿主細(xì)胞免疫功能,有利于胞內(nèi)生長(zhǎng)繁殖。嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體侵入粒細(xì)胞過(guò)程中,其表面膜蛋白最先與宿主細(xì)胞發(fā)生相互作用,完成細(xì)菌侵入機(jī)體的黏附內(nèi)吞過(guò)程;嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體進(jìn)入粒細(xì)胞后,一些分泌蛋白、包涵體膜蛋白等對(duì)病原的包內(nèi)寄居有重要作用,但其分子致病機(jī)理尚不完全清

3、楚。近年來(lái)粒細(xì)胞無(wú)形體病特別是HGA案例世界范圍內(nèi)有增加趨勢(shì),引起世界各國(guó)的廣泛關(guān)注。我們對(duì)我國(guó)人粒細(xì)胞無(wú)形體病(HGA)流行病學(xué)進(jìn)行了調(diào)查,臨床表現(xiàn)為重癥型。本文擬對(duì)我國(guó)部分地區(qū)無(wú)形體病流行情況進(jìn)行調(diào)查,并對(duì)人粒細(xì)胞無(wú)形體致病過(guò)程中的表面蛋白、分泌蛋白作用進(jìn)行了探討。本研究開展如下工作:
　　1.了解云南曲靖、山西呂梁兩省/市鼠傳無(wú)形體流行特征。無(wú)菌條件下收集的鼠脾臟樣本用組織破碎儀破碎后試劑盒抽提基因組,巢式 PCR檢測(cè)疑似陽(yáng)

4、性產(chǎn)物送測(cè)序并進(jìn)行序列信息分析。研究結(jié)果表明,云南曲靖優(yōu)勢(shì)鼠種為褐家鼠和黃胸鼠,立克次體總陽(yáng)性率為1.7％,細(xì)菌有立克次體屬(Rickettsia)、埃立克體屬(Ehrlichia)、無(wú)形體屬(Anaplasma)、沃爾巴克體屬(Wolbachia)等多個(gè)種屬,提示中國(guó)云南曲靖鼠類自然感染病原種類較復(fù)雜,變異較大。山西呂梁優(yōu)勢(shì)鼠種為黑線姬鼠,立克次體總陽(yáng)性率為5.9%,立克次體種類僅有查菲埃立克體(Ehrlichia chaffeens

5、is)。由此得出結(jié)論是云南曲靖、山西呂梁兩地區(qū)嚙齒動(dòng)物中存在立克次體自然感染現(xiàn)象,嚙齒動(dòng)物可能是該地區(qū)立克次體病原的一個(gè)自然疫源宿主。
　　2.構(gòu)建人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP-1)cDNA文庫(kù)。提取人單核細(xì)胞白血病細(xì)胞THP-1總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA, LD-PCR擴(kuò)增獲得雙鏈cDNA,用CHROMA SPIN+TE-400純化柱純化的雙鏈cDNA與pGADT7-Rec載體共轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y187,構(gòu)建cDNA文庫(kù)。得

6、到了人THP-1細(xì)胞cDNA文庫(kù)的庫(kù)容為4.0×106,重組率為96.1%,插入片段大小在100-3000bp,且片段條帶豐度位于500-2000bp之間,已達(dá)到建庫(kù)要求。為進(jìn)一步篩選與嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體 LZ-HGA-Agent MSP2蛋白、Ats-1蛋白相互作用的THP-1細(xì)胞潛在蛋白奠定了基礎(chǔ)。
　　3.篩選與中國(guó)人源嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體分離株LZ-HGA-Agent Msp2、Ats-1相互作用的人THP-1細(xì)胞潛在靶蛋白,為

7、無(wú)形體分子致病機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。以中國(guó)人源嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體分離株LZ-HGA-Agent表面膜蛋白Msp2、分泌蛋白 Ats-1和人THP-1細(xì)胞為主要研究對(duì)象,通過(guò)生物信息學(xué)分析,選擇編碼Msp2蛋白完整開放閱讀框、Ats-1蛋白部分開放閱讀框作為克隆目標(biāo),通過(guò)引物設(shè)計(jì),PCR擴(kuò)增目的基因 msp2、ats-1,連接等構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-msp2、pGBKT7-ats-1并轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold菌株,最后經(jīng)自激活檢測(cè)和毒性檢

8、測(cè)證實(shí)成功構(gòu)建含誘餌質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子;采用研究蛋白-蛋白互作的酵母雙雜交經(jīng)典技術(shù)篩選互作蛋白。以上研究結(jié)果表明,篩選到與表面蛋白 Msp2互作的THP-1細(xì)胞潛在蛋白主要有NADH脫氫酶(泛醌)1α亞體13(NDUFA13)、鋅指蛋白36,C3H樣2(ZFP36L2)、核糖體蛋白L11(RPL11)、前胸腺素α(PTMA)、Homo sapiens chromosome19 open reading frame10(C19orf10)、

9、組織蛋白酶G(CTSG)、核糖體蛋白S25(RPS25)七個(gè)陽(yáng)性潛在蛋白,而與分泌蛋白Ats-1互作的THP-1細(xì)胞潛在蛋白主要有真核翻譯延伸因子1α1亞基(EEF1A1)、金屬蛋白酶抑制子1(TIMP1)、鋅指蛋白36,C3H樣2(ZFP36L2)、半乳糖凝集素1(LGALS1)、前胸腺素α(PTMA)、Homo sapiens Williams Beuren syndrome chromosome region22(WBSCR22)

10、、吸引素(ATRN)七個(gè)陽(yáng)性潛在蛋白。
　　4.鑒定與Msp2、Ats-1蛋白真正互作的靶蛋白。為了進(jìn)一步鑒定篩選到的中國(guó)人源嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體分離株表面蛋白Msp2、分泌蛋白Ats-1互作的THP-1細(xì)胞真正潛在蛋白,利用免疫共沉淀技術(shù)、Western blot技術(shù)驗(yàn)證部分互作蛋白。研究結(jié)果表明,最終驗(yàn)證嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體分離株表面蛋白Msp2與THP-1細(xì)胞的組織蛋白G(CTSG)、鋅指蛋白36,C3H樣2(ZFP36L2)蛋白發(fā)

11、生相互作用;分泌蛋白Ats-1與THP-1細(xì)胞的半乳糖凝集素1(LGALS1)、金屬蛋白酶抑制子1(TIMP1)蛋白發(fā)生相互作用。
　　總之,本研究檢測(cè)到云南曲靖、山西呂梁鼠類中立克次體病原分布情況,證實(shí)了云南曲靖地區(qū)存在多種立克次體病原,研究結(jié)果可以為上述兩地區(qū)立克次體病防控提供指南;同時(shí)本研究成功篩選到中國(guó)人源嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體分離株Msp2、Ats-1蛋白相互作用的THP-1潛在蛋白,這些潛在蛋白可能跟中國(guó)人源嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體