深海熱液區(qū)嗜熱菌噬菌體D6E的分子特征及GVE2與宿主的蛋白質互作研究.pdf

1、海洋占整個地球表面積的71％，多樣性的生態(tài)環(huán)境蘊藏著豐富的生物資源。深海熱液口是地球上一個極其惡劣的生存環(huán)境-高溫、高壓、缺氧、含有大量有毒的化學物質，但是其中及其周圍卻存在著一個完整的生態(tài)系統(tǒng)。噬菌體被認為是地球上最豐富的生命體，幾乎可以在地球上的每個生態(tài)環(huán)境中找到，同樣也暗示著它們在微生物多樣性和生態(tài)平衡上發(fā)揮著重要作用。嗜熱菌作為深海熱液口生態(tài)群落的初級生產(chǎn)者，是推動營養(yǎng)和能量循環(huán)的主要動力。噬菌體是一類特殊群體，它們寄生在細菌體

2、內，根據(jù)環(huán)境變化發(fā)生溶原或者裂解，從而引起宿主菌在整個生態(tài)群落中的分布。由于深海熱液口在地理分布上具有一定的獨立性，所以噬菌體與宿主的關系直接影響著整個熱液口生態(tài)群落的存在和結構。隨著基因組測序技術的發(fā)展，越來越多的噬菌體基因組信息添加到基因組數(shù)據(jù)庫中，這為噬菌體生物信息學研究提供了大量的數(shù)據(jù)，不僅包括噬菌體序列之間的分析，還有利于研究噬菌體群體之間的結構組成。噬菌體的基因組雖然很小，但是卻編碼了自身復制所需的蛋白，如DNA包裝蛋白、頭

3、尾結構蛋自、DNA復制相關蛋白、轉錄調控蛋白、裂解相關蛋白等。通過比較基因組學，可以得到大量的基因多樣性數(shù)據(jù)，同時發(fā)現(xiàn)基因組之間存在著非常明顯的序列相似性。這些序列可以通過同源或者點特異性重組促進噬菌體基因模塊發(fā)生互換；或者，通過非定向的遍及整個基因組發(fā)生非同源重組。 在本論文中，通過各種篩選培養(yǎng)基對深海熱液區(qū)樣品中的嗜熱菌和高溫噬菌體進行了分離、純化，并得到了4株高溫噬菌體，對其中的高溫噬菌體D6E進行了進一步研究。結果表明，

4、高溫噬菌體D6E為肌尾科病毒，有二十面體的頭部，長長的尾巴和尾絲。經(jīng)測序，D6E基因組有49335 bp，為雙鏈環(huán)狀DNA，可以編碼49個預測有功能的蛋白。和其它噬菌體一樣，D6E的基因排列也是成簇分布的，按功能可以分為四個部分：DNA包裝和頭部裝配、尾部組成、溶原與裂解、DNA復制和轉錄。通過在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析發(fā)現(xiàn)，D6E的大部分結構相關蛋白與已知噬菌體蛋白的同源性非常低，但是溶原和裂解相關基因以及DNA復制和轉錄相關基因

5、的核苷酸序列與本實驗室另外一株已測序的高溫噬菌體GVE2不管在基因排列、還是這些基因編碼的氨基酸序列上都具有非常高的相似性。采用蛋白質組學技術，對D6E病毒粒子的蛋白質組進行了分析，結果得到了10個與結構相關的蛋白，包括核衣殼蛋白、入口蛋白、支架蛋白等，其中質譜匹配率非常高的兩個未知蛋白ORF3(第3條帶)和ORF16(第9條帶)的功能有待進一步研究。 根據(jù)本實驗室分離獲得的深海嗜熱菌噬菌體GVE2基因組測序結果和預測閱讀框分析

6、，重組表達并純化了20個GVE2蛋白，制備相應的多克隆抗體，采用Western Blot對噬菌體的基因表達進行了分析。通過免疫共沉淀(Co-IP)和GST下拉(GST pull-down)試驗尋找在感染過程中GVE2與宿主可能發(fā)生相互作用的蛋白。通過實驗，得到了兩種蛋白復合體：與GVE2 ORF5(核衣殼蛋白，VP371蛋白)相互作用的分子伴侶蛋白；與GV2 ORF36相互作用的未知蛋白。本實驗室前期工作中發(fā)現(xiàn)宿主的天冬氨酸轉氨酶和分子

7、伴侶蛋白參與了噬菌體的感染過程，因此，本試驗進一步研究噬菌體GVE2 VP371蛋白與宿主天冬氨酸轉氨酶和分子伴侶形成的蛋白復合體在噬菌體感染中的作用。Western blot和細菌雙雜交試驗結果顯示，VP371蛋白和分子伴侶蛋白之間、分子伴侶蛋白和天冬氨酸轉氨酶之間存在相互作用，而VP371蛋白和天冬氨酸轉氨酶之間沒有相互作用，復合體中3個蛋白呈串聯(lián)結構結合在一起。在噬菌體感染實驗中我們發(fā)現(xiàn)，隨著感染時間的增加，VP371的轉錄表達量

8、逐漸增大，同時分子伴侶蛋白和天冬氨酸轉氨酶都比未感染時有了明顯上調表達。因此，在噬菌體感染過程中，GVE2核衣殼蛋白VP371和宿主的分子伴侶蛋白發(fā)生相互作用，并依次遞進促進了分子伴侶蛋白和天冬氨酸轉氨酶的上調表達，從而進一步調控了宿主細胞的代謝活動。 本論文對對高溫噬菌體GVE2的ORF3(入口蛋白)和ORF56(胸腺嘧啶合成酶)進行了功能鑒定。ORF3預測為噬菌體入口蛋白，雖然在氨基酸序列上它與其他噬菌體具有很低的同源性，但

9、與SPP1、HK97的入口蛋白都具有相似的螺旋/折疊排列結構，屬于HK97入口蛋白家族，在DNA包裝過程中發(fā)揮著相同的功能。預測二級結構分析發(fā)現(xiàn)，GVE2同SPP1和Phi29都具有非常保守的α-Helices，可能是在基因組包裝過程中保留下來的一種古老結構域。通過免疫電鏡定位，結果表明入口蛋白位于頭尾的連接處。Orf56編碼原核型的胸腺嘧啶合成酶，與已知的不同物種的胸腺嘧啶合成酶有很高的相似性。ORF56中可以找到符合胸腺嘧啶合成酶的