深海嗜熱噬菌體GVE2裂解宿主菌的機制及GVE2感染相關代謝物的功能研究.pdf

1、眾所周知，海洋覆蓋了地球70％多的地表，蘊育著豐富和獨特的生物資源，相比于陸生生物資源，人們對于海洋生物資源的認識和開發(fā)還處于起步階段。自從1977年美國阿爾文號深潛器在太平洋首次發(fā)現(xiàn)了深海熱液口后，深海熱液口的生態(tài)系統(tǒng)和生物資源便受到了人們極大的關注。在深海熱液口生態(tài)系統(tǒng)中，一些化能合成細菌和古菌能夠利用地熱能和化能來合成有機物，它們是整個生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈的基礎。近年來的研究發(fā)現(xiàn)在這些細菌和古細菌中存在著大量的病毒，這些病毒能夠通過裂

2、解細菌和古菌來破壞食物鏈的基礎從而極大地影響熱液口生態(tài)系統(tǒng)的群落結(jié)構(gòu)。同時，這些嗜熱病毒還能夠通過裂解宿主菌釋放出可溶性的有機物來參與地球化學物質(zhì)循環(huán)。因此對嗜熱病毒尤其是嗜熱菌噬菌體裂解宿主菌分子機理的研究，不僅能讓我們了解在高溫條件下病毒是如何裂解宿主菌的，而且在我們理解嗜熱病毒對深海熱液口生物群落和地球化學物質(zhì)循環(huán)的作用方面具有非常重要的意義。
　　本試驗研究了深海熱液口高溫噬菌體GVE2裂解其宿主嗜熱細菌Geobacill

3、ussp.E263的分子機理。我們的研究發(fā)現(xiàn)，作為雙鏈DNA噬菌體，GVE2能通過編碼兩種蛋白endolysin和holin來參與宿主菌的裂解過程。endolysin蛋白是—種胞質(zhì)蛋白，具有多種肽聚糖水解酶活性，它能夠特異性地識別和降解宿主菌的細胞壁。然而endolysin蛋白自身不能跨膜運輸?shù)郊毎谏?，它需要另外—個蛋白holin的輔助。holin蛋白是噬菌體編碼的—種膜蛋白，在特定的時間和條件下，它能夠在細胞膜上聚合并形成孔洞復合物

4、，幫助endolysin蛋白從胞質(zhì)中釋放到細胞壁上。
　　為了研究holin和endolysin蛋白在裂解中的作用，首先我們研究了GVE2感染的宿主菌Geobacillus sp.E263的生長曲線，結(jié)果表明GVE2的感染能夠?qū)е滤拗骶牧呀?。接著，通過熒光顯微鏡觀察到在GVE2感染后endolysin-GFP能夠在宿主菌中聚集，表明endolysin蛋白在宿主菌裂解中發(fā)揮重要作用。隨后，我們通過Northernblot和West

5、ern blot研究GVE2感染后宿主菌內(nèi)endolysin和holin的表達量，結(jié)果表明從GVE2感染開始到宿主菌的裂解，endolysin和holin蛋白在宿主菌內(nèi)部表達。細菌雙雜交試驗表明，宿主ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ABC transporter)能與噬菌體編碼的endolysin蛋白相互作用。ABC transporter蛋白是—種依賴于ATP的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，ABC transporter與endolysin蛋白的相互作用可能有助于e

6、ndolysin從細胞質(zhì)中的釋放，進而促進宿主菌的裂解。
　　在了解GVE2裂解宿主嗜熱細菌Geobacillus sp.E263的分子機理后，我們研究了細菌骨架蛋白MreB在GVE2侵染中的作用。MreB是一種在大多數(shù)桿狀細菌中都存在的骨架蛋白，它與真核生物細胞的肌動蛋白actin具有同源性，MreB在維持細菌形態(tài)以及引導細菌細胞壁肽聚糖合成過程中發(fā)揮著非常重要的作用。本試驗通過相差顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，MreB的特異性抑制劑A22和

7、MP265能夠通過抑制細菌MreB的聚合來改變細菌的形態(tài)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，MreB-GFP能夠與GVE2病毒顆粒共定位，結(jié)果揭示宿主MreB的聚合影響GVE2的侵染。
　　我們進一步探尋從深海熱液口微生物中獲得有益生物資源的可能性。在噬菌體感染宿主菌后，宿主菌抵御噬菌體侵染可體現(xiàn)在蛋白、代謝物等分子水平。尤其是宿主菌在代謝水平上的擾動可能會產(chǎn)生一些具有抗噬菌體活性的小分子化合物，這些活性化合物可能具有潛在的抗病毒和腫瘤的活

8、性。為此在本試驗中，我們通過GC-MS和LC-MS方法分析了GVE2感染和未感染條件下宿主菌Geobacillus sp.E263的次生代謝產(chǎn)物變化。
　　通過分析發(fā)現(xiàn)，有27種代謝物含量發(fā)生了顯著變化，對其中3種GVE2感染后上調(diào)的代謝物色醇、對羥基苯甲醇、腺嘌呤進行了進一步研究。熒光定量PCR試驗表明，色醇能夠顯著地抑制GVE2的感染和復制，而腺嘌呤能夠促進GVE2的感染和復制。進一步試驗發(fā)現(xiàn)，色醇能夠與宿主的Clp蛋白酶發(fā)生

9、相互作用。Clp蛋白酶是細菌中的一種蛋白水解酶，它能夠通過水解細菌中的蛋白底物來幫助細菌在逆境中生存。同時，還有研究報道發(fā)現(xiàn)Clp蛋白酶在噬菌體感染大腸桿菌的過程中發(fā)揮著重要的作用。因此，在本研究中色醇可能是通過與Clp蛋白酶的相互作用來參與宿主菌對噬菌體侵染和裂解的抵御。
　　另一方面，我們研究了GVE2感染相關代謝產(chǎn)物在抗腫瘤中的作用。研究結(jié)果表明，GVE2感染的Geobacillussp.E263代謝粗提物能夠特異性地抑制胃

10、癌細胞系AGS的生長，而不影響胃正常上皮細胞系GES的生長。通過對Geobacillus sp.E263的代謝粗提物進行半制備型高效液相色譜分離，我們純化得到一個能特異性抑制胃癌細胞系AGS生長的代謝物，氣相色譜-質(zhì)譜分析表明純化到的活性物質(zhì)可能是—種新的化合物。
　　本論文圍繞嗜熱細菌Geobacillus sp.E263與其嗜熱噬菌體GVE2在蛋白和代謝物水平上的相互作用關系展開研究。首先通過研究噬菌體編碼的endolysin

11、蛋白和宿主菌的ABC transporter蛋白的相互作用關系，闡述了在高溫條件下噬菌體裂解宿主菌的分子機制。其次，我們研究了細菌骨架MreB在GVE2侵染中的作用。
　　最后，我們探尋了從深海熱液口微生物中開發(fā)生物資源的可能性，我們通過代謝組學方法研究了Geobacillus sp.E263在GVE2感染和未感染條件下的代謝譜圖，獲得27個與GVE2感染相關的代謝物。由于噬菌體能夠通過裂解宿主菌來影響熱液口生態(tài)系統(tǒng)，因此本文的研