嗜吞噬細胞無漿體分子流行病學及遺傳進化研究.pdf

1、近年來，嗜吞噬細胞無漿體（Anaplasma phagocytophilum，AP）已成為全球范圍內(nèi)一種危害公共健康的重要蜱傳病原。這種革蘭氏陰性菌營專性胞內(nèi)寄生，主要感染宿主動物的末梢血中性粒細胞，其宿主譜十分廣泛，包括人、野生動物（如白尾鹿、梅花鹿等）、家畜（如犬、馬、牛、羊等）、嚙齒類動物（如白足鼠、林鼠等）、食蟲類動物（如鼩鼱、刺猬等）。該病原在人體內(nèi)可引起人粒細胞無形體病(Human granulocytic anaplasm

2、osis，HGA)，在動物體內(nèi)則可導致蜱源熱(Tick borne fever，TBF)，給養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成重大損失，并可危及人類健康。然而該病原在我國動物中的流行情況還不甚明了，且AP不同分離株之間差異較大，因此，詳細了解我國部分地區(qū)、不同動物和媒介蜱AP的流行情況以及不同AP分離株之間的遺傳差異，對于深入研究嗜吞噬細胞無漿體病的發(fā)生和流行情況，進而有效防控該病及保護動物健康和公共衛(wèi)生安全等具有重要意義。
　　1.AP分子流行病

3、學調(diào)查
　　2013年-2015年，為詳細了解我國AP流行情況，自河南、陜西、云南、貴州等9個?。ㄊ小⒆灾螀^(qū)）采集綿羊、山羊、牛、犬、非洲長頸鹿血液樣品2104份，其中羊血液樣品1516份（含本實驗室保存羊血液樣品474份）、羊奶樣品120份、牛血液樣品69份、犬血液樣品240份、非洲長頸鹿血液樣品1份和硬蜱樣品158份，采用血液涂片姬姆薩染色法、硬蜱透明鏡檢法和巢式PCR方法特異性擴增AP、Anaplasma bovis16S

4、rRNA和Anaplasmaovis msp4基因片段。結(jié)果顯示，共計2053份DNA樣品中，無漿體總陽性率為38.4％(788/2053)，3.0％(61/2053)為AP陽性。其中在1516份羊血液樣品中，無漿體總陽性率為45.0％(683/1516)，AP陽性率為3.4％(52/1516);不同品種羊的無漿體陽性率也不同，綿羊無漿體總陽性率為40.6％(262/646)，AP的感染率為5.6％(36/646)，山羊無漿體總陽性率高

5、達51.3％(424/870)，AP陽性率1.8％(16/870)，低于綿羊中AP感染率;連續(xù)4年采集自河南洛陽宜陽趙堡鄉(xiāng)的羊血樣品中，無漿體總陽性率高達78.2％，其中AP陽性率也高達47.3％(78/165)，這可能與該地區(qū)位于豫西山區(qū)且羊群多以放牧為主而與媒介碘蜱接觸較多有關(guān);12.5％(15/120)的羊奶樣品為無漿體陽性，其中AP陽性的羊奶樣品2份，且凡是羊奶樣品檢測為某種無漿體陽性者，其對應(yīng)的血液樣品也為該種無漿體陽性;69

6、份牛血樣品中，31.9％(22/69)為無漿體陽性，1份為AP陽性，有部分樣品同時感染4種病原;血液涂片染色、PCR檢測及牛體表碘蜱攜帶病原檢測三方面的結(jié)果共同證實來自該牛場的?；加刑├障x病/無漿體病;240份犬血液樣品中，有3份流浪犬樣品和1份羊場飼養(yǎng)的犬樣品為AP陽性;107份蜱樣品經(jīng)種類鑒定后為:85份長角血蜱，16份微小扇頭蜱，6份褐黃血蜱，其中1只長角血蜱為AP陽性;首次從動物園引進飼養(yǎng)的非洲長頸鹿體內(nèi)檢測到AP，以及AP、A

7、.bovis和Theleria sp.的混合感染。上述結(jié)果表明在本研究采樣地區(qū)的動物體內(nèi)無漿體感染較普遍，且多種動物均感染AP，這提示我們關(guān)注AP對畜牧業(yè)造成的影響，另外在林牧區(qū)的工作人員和旅行者應(yīng)加強自我保護意識，避免因被蜱蟲叮咬而罹患無漿體病。
　　2.AP的遺傳差異分析
　　為了解我國部分地區(qū)AP的遺傳差異，對所獲得的220份AP陽性樣品，采用巢式PCR方法特異性擴增得到AP的16S rRNA、msp4、groESL和

8、gltA四個基因的部分序列，應(yīng)用Vector NTI Advance10軟件對序列進行校對及拼接，將所得序列在NCBI的BLASTn中進行同源性比對，隨后使用Mega5.05軟件對核苷酸序列及由其推倒出的氨基酸序列進行分子發(fā)育分析并構(gòu)建進化樹。本文共得到16S rRNA基因長片段31條，gltA基因序列118條，groEL基因序列162條，msp4基因序列52條。31條168rRNA基因長片段中，有12條差異序列，其中，序列KX5052

9、92為查菲氏埃里希氏體(Ehrlichia chaffeensis)，且與美國的一人源分離株(CP007479)位于同一個進化分支上，KX505293和KX505302代表的分離株與一株來自中國的人源無漿體分離株(KM206273)序列相同;118條gltA核苷酸序列中，存在8種有差異序列，推倒出的氨基酸序列存在7種序列，氨基酸序列構(gòu)建的進化樹上，本文得到的gltA形成兩支，其中，clusterⅠ中包含了絕大部分序列，且包含一株人獸共患

10、分離株KJ700628;162條groEL核苷酸序列，存在10種有差異核苷酸序列和3種差異氨基酸序列，氨基酸和核苷酸序列的進化樹上均顯示，本文得到的序列單獨成支，與現(xiàn)有序列差異較大，相似度最高的也僅有90.3％（JN055360和JQ685509）;52條msp4核苷酸序列存在13種核苷酸序列和3種氨基酸序列，本文得到的序列在進化樹上形成分離的兩個支，clusterⅡ中囊括了除來自陜西麟游、山西晉城和河南洛陽宜陽的部分分離株，可見陜西麟

11、游和山西晉城地區(qū)的msp4基因序列相對保守，而河南洛陽宜陽地區(qū)的msp4基因則出現(xiàn)分化;220份16SrRNA基因短片段的進化分析顯示，本文的序列分成三簇，其中clusterⅠ涵蓋了本文得到的綿羊、山羊、犬、牛、長頸鹿、蜱來源的AP分離株序列以及已報道的其他動物源分離株，clusterⅢ中僅有的一條序列與兩株人源分離株親緣關(guān)系較近(NR044762和AF093788)，顯示一定的人獸共患傾向。
　　基于16S rRNA基因長片段和