EB病毒LMP1調(diào)控Op18-stathmin信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、EBV與鼻咽癌發(fā)病密切相關(guān)。在鼻咽癌細(xì)胞中，EBV潛伏感染時(shí)主要表達(dá)兩種潛伏膜蛋白LMP1、LMP2，其中LMP1已被確證具有瘤蛋白功能，可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，使永生化的細(xì)胞具有致瘤性。我們已經(jīng)證實(shí)，EB病毒瘤蛋白LMPl可以異常激活A(yù)P-1、NFkB、STAT三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和磷酸化這三條信號(hào)通路中的EGFR，JNK，JAK，STAT，IkB，c-Jun等蛋白質(zhì)分子，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育與分化增殖。

2、 EB病毒瘤蛋白LMP1調(diào)節(jié)的下游磷酸化蛋白質(zhì)分子，重要的信號(hào)分子或下游功能效應(yīng)蛋白質(zhì)分子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有得到全面地闡明。我們前期利用磷酸基團(tuán)金屬離子親和層析(PMAC)技術(shù)富集磷酸化蛋白質(zhì)策略，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)高通量技術(shù)，在LMP1介導(dǎo)AP-1、NFkB和STAT三條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基礎(chǔ)上，依據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，建立了LMP1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路虛擬網(wǎng)絡(luò)，獲得了25個(gè)新的受LMP1調(diào)控的差異磷酸化蛋白質(zhì)分子，其中包括Op18/stathmin。

3、 確立LMP1通過MAPK與cdc2介導(dǎo)的對(duì)Op18/stathmin信號(hào)通路，將進(jìn)一步完善了LMP1信號(hào)通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，確立Op18/stathmin為L(zhǎng)MP1的一個(gè)新的效應(yīng)分子提供分子證據(jù)，對(duì)闡明LMP1在癌變中的分子機(jī)制有重要的意義。 1.LMPl對(duì)Op18/stathmin表達(dá)與磷酸化調(diào)節(jié)CNE1是LMP1陰性的鼻咽癌細(xì)胞，CNE1-LMP1是穩(wěn)定表達(dá)LMP1的鼻咽癌低分化鱗狀癌細(xì)胞；LMP1受DOX誘導(dǎo)表達(dá)的Tet

4、-on-LMP1-HNE2鼻咽癌細(xì)胞；來(lái)源于SV40T轉(zhuǎn)化的永生化鼻咽部上皮細(xì)胞NP69、NP69-PIMSX、NP69-LMP1的NP69細(xì)胞系列。通過不同細(xì)胞株的研究表明，鼻咽癌細(xì)胞與人永生化鼻咽部細(xì)胞，LMP1對(duì)Op18/stathmin表達(dá)沒有影響，也沒有時(shí)間與劑量依賴性；LMP1顯著誘導(dǎo)Op18/stathmin磷酸化水平上調(diào)；但在鼻咽部黏膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的永生化細(xì)胞NP69系列，LMP1誘導(dǎo)Op18/stathmin磷酸化改變

5、不明顯。LMP1調(diào)節(jié)Op18/stathmin主要通過影響Op18/stathmin磷酸化實(shí)現(xiàn)的，其對(duì)腫瘤細(xì)胞與永生化的細(xì)胞作用機(jī)制可能存在一定的差異。 2.LMP1通過MAPK對(duì)Op18/stathmin信號(hào)通路的調(diào)控在鼻咽癌細(xì)胞中，LMP1能否通過MAPK調(diào)控Op18/stathmin信號(hào)通路。LMPl陰性的CNE1與穩(wěn)定表達(dá)LMP1的CNE1-LMP1鼻咽癌低分化鱗狀癌細(xì)胞系，通過細(xì)胞同步化，特異阻斷MAPK信號(hào)通路，免疫

6、共沉淀，可溶性與聚合性微管蛋白的萃取，Western-blot分析等方法，研究LMP1對(duì)MAPK激酶活性影響，MAPK與Op18/stathmin相互作用的改變，微管動(dòng)力學(xué)變化，及LMP1調(diào)控MAPK活性改變與細(xì)胞周期的相關(guān)性。 研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞絕大部分處于G1/S期，LMP1上調(diào)p38、ERK、JNK/MAPK磷酸化，其中ERK磷酸化水平顯著升高；當(dāng)絕大部分細(xì)胞處于G2/M期時(shí)，與G1/S期剛好相反，LMP1負(fù)性調(diào)控p38、E

7、RK和JNK/MAPK激酶磷酸化，ERK磷酸化水平下降最為顯著。 為了證實(shí)Op18/stathmin失穩(wěn)定微管的活性，我們?cè)O(shè)計(jì)了靶向Op18/stathmin的siRNA重組載體，觀察在Op18/stathmin基因表達(dá)被抑制情況下，微管動(dòng)力學(xué)的改變。研究發(fā)現(xiàn)，RNAi有效抑制Op18/stathmin轉(zhuǎn)錄及Op18/stathmin蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染pGCsi.U6/neo/GFP空白質(zhì)粒與pGCsi.U6/neo/GFP-NON

8、無(wú)意義質(zhì)粒的對(duì)照組中，可溶性微管蛋白水平無(wú)明顯變化，但轉(zhuǎn)染pGCsi.U6/neo/GFP-RNAi質(zhì)粒的處理組，可溶性微管蛋白水平明顯下降。證實(shí)，在鼻咽癌細(xì)胞中，活性O(shè)p18/stathmin促進(jìn)微管解聚，抑制Op18/stathmin活性表達(dá)，將促進(jìn)微管的穩(wěn)定。 采用免疫共沉淀方法，確定DZ1阻斷LMP1表達(dá)的情況下，MAPK與Op18/stathmin相互作用及與LMP1調(diào)控關(guān)系。結(jié)果可見，隨DZ1抑制濃度加大，與Op18

9、/stathmin相互作用的MAPK磷酸化水平下降；DZ1阻斷可導(dǎo)致可溶性微管蛋白比例增加，聚合性微管蛋白比例減少，與LMP1正性調(diào)控MAPK激酶活性，導(dǎo)致Op18/stathmin磷酸化水平增加，失穩(wěn)定微管活性下降，促進(jìn)微管聚合作用相一致。由于未經(jīng)秋水仙胺處理細(xì)胞絕大多數(shù)處于G1/S期(83.9％)，說明在G1/S期，LMP1通過誘導(dǎo)MAPK激酶表達(dá)與磷酸化介導(dǎo)Op18/stathmin磷酸化失活，促進(jìn)微管聚合，保證間期微管的相對(duì)穩(wěn)定

10、。 PD98059選擇性阻斷MAPK家族中的主要傳導(dǎo)通路ERK/MAPK，隨PD98059濃度抑制劑濃度增加，P-Op18水平有所下降，微管解聚，聚合性微管蛋白比例下降。 在G1/S期，LMP1通過MAPK介導(dǎo)正性調(diào)控Op18/stathmin信號(hào)；在G2/M期，LMP1通過MAPK介導(dǎo)負(fù)性調(diào)控Op18/stathmin的信號(hào)；在MAPK家族，LMP1主要通過ERK/MAPK介導(dǎo)影響Op18/stathmin信號(hào)，是主要

11、的調(diào)控途徑。G2/M期，LMP1負(fù)性調(diào)節(jié)MAPK活性機(jī)制有多種可能性，如ode2、p53等的參與。 3.LMP1通過cdc2調(diào)控Op18/stathmin信號(hào)通路 由于Op18/stathmin信號(hào)傳導(dǎo)與細(xì)胞周期密切相關(guān)，而cdc2是一種有絲分裂期依賴激酶，細(xì)胞周期的正向調(diào)控子，我們進(jìn)一步檢測(cè)cdc2活性變化與LMP1相關(guān)性，探索LMP1通過cdc2介導(dǎo)Op18/stathmin信號(hào)通路的調(diào)控。 采用M期細(xì)胞同步

12、化處理，cdc2激酶活性分析，免疫共沉淀分析cdc2與Op18/stathmin相互作用，微管動(dòng)力學(xué)分析與免疫熒光分析等發(fā)現(xiàn)，LMP1不影響cdc2表達(dá)；M期，LMP1顯著上調(diào)cdc2的Thr161磷酸化與cdc2激酶活性，Op18/stathmin磷酸化水平同步升高。CO-IP-Westem-blot分析發(fā)現(xiàn)，LMP1促進(jìn)cdc2與Op18/stathmin相互作用，這種相互作用在M期被顯著增強(qiáng)；免疫熒光與Western-blot分析

13、發(fā)現(xiàn)，有絲分裂期，LMP1誘導(dǎo)紡錘體微管形成，與Op18/stathmin磷酸化失活，促進(jìn)微管聚合作用相一致。特異性靶向LMP1的脫氧核酶抑制劑DZ1抑制LMP1表達(dá)后，cdc2激酶活性下調(diào)，cdc2與Op18/stathmin相互作用減弱，聚合性微管蛋白比例下降；CDK1阻斷劑Purvalanol A能有效抑制cdc2激酶活性，抑制Op18/stathmin磷酸化，促進(jìn)微管解聚，進(jìn)一步說明LMP1可以通過cdc2介導(dǎo)調(diào)節(jié)Op18/st

14、athmin信號(hào)通路。 小結(jié)： 我們采用鼻咽癌細(xì)胞為模型，采用細(xì)胞同步化，可溶性與聚合性微管蛋白萃取，免疫熒光，Western-blot分析等技術(shù)，結(jié)合信號(hào)傳導(dǎo)中信號(hào)阻斷策略，研究LMP1對(duì)Op18/stathmin信號(hào)通路的調(diào)控，取得了如下發(fā)現(xiàn)： 1)LMP1不影響Op18/stathmin表達(dá)，但上調(diào)Op18/stathmin磷酸化。對(duì)鼻咽部上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化的永生化細(xì)胞NP69系列影響不明顯，提示在鼻咽癌細(xì)胞與鼻

15、咽部黏膜上皮細(xì)胞，LMP1調(diào)節(jié)Op18/stathmin信號(hào)通路機(jī)制可能存在差異。 2)在鼻咽癌細(xì)胞，首次證明LMP1對(duì)MAPK活性調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)聯(lián)。在G1/S期，LMP1正性調(diào)節(jié)MAPKs系列激酶；在G2/M期，負(fù)性調(diào)節(jié)MAPKs激酶活性，其中ERK/MAPK是其主要的調(diào)控途徑；靶向Op18/stathmin的RNAi實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Op18/stathmin在NPC細(xì)胞是一種微管失穩(wěn)定活性分子，抑制Op18/stathmin的

16、表達(dá)，會(huì)促進(jìn)微管聚合。在G1/S期，LMP1促進(jìn)MAPK與Op18/stathmin相互作用。LMP1通過MAPK介導(dǎo)的Op18/stathmin信號(hào)通路的調(diào)控，主要發(fā)生在G1/S期，與間期的微管穩(wěn)定性有關(guān)。 3)LMP1對(duì)細(xì)胞周期正向調(diào)控因子cdc2的表達(dá)無(wú)影響，但LMP1能上調(diào)cdc2的Tbr161的磷酸化水平，促進(jìn)M期cdc2激酶活性顯著上升；在M期，LMP1誘導(dǎo)Op18/stathmin磷酸化水平顯著上升，與cdc2激酶

17、活性改變一致；LMP1促進(jìn)cdc2與Op18/stathmin相互作用，促進(jìn)有絲分裂期紡錘體微管的聚合。LMP1通過ode2介導(dǎo)的Op18/stathmin信號(hào)通路的調(diào)控，主要發(fā)生在M期，與有絲分裂期紡錘體形成有關(guān)。 以上結(jié)果證明：LMP1能通過MAPKs與cdc2激酶調(diào)控Op18/stathmin信號(hào)通路，影響微管聚合與解聚的動(dòng)態(tài)平衡，這種作用與細(xì)胞周期密切相關(guān)，具有細(xì)胞周期特異性。兩條信號(hào)通路作用機(jī)制不一樣，其調(diào)控的生物學(xué)效