EB病毒致瘤蛋白LMP1調(diào)節(jié)p53功能活性的研究.pdf

1、鼻咽癌是中國(guó)南方高發(fā)的腫瘤，具有人種和人群的易感性、家族聚集現(xiàn)象、低分化和高轉(zhuǎn)移為主的臨床病理特征，并與EB病毒高度相關(guān)。其中EB病毒編碼的潛伏膜蛋白LMP1是重要的致瘤蛋白，以鼻咽癌為切入點(diǎn)，我們多年的研究工作一直致力于LMP1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。從建立LMP1可調(diào)控表達(dá)體系入手，以細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-kB、AP-1、STAT作為樞紐，系統(tǒng)地研究了LMPl介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常以及由此產(chǎn)生的一系列生物學(xué)效應(yīng)。

2、p53是重要的抑瘤基因，作為細(xì)胞基因組穩(wěn)定性的“守護(hù)神”(guardian)，p53蛋白對(duì)細(xì)胞的存活具有雙面性(double faces)：p53通過(guò)作用于受損細(xì)胞的細(xì)胞周期限制點(diǎn)，延緩細(xì)胞周期行進(jìn)，以使細(xì)胞在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂前修復(fù)DNA損傷保證細(xì)胞高質(zhì)量存活；但當(dāng)DNA損傷超過(guò)細(xì)胞的修復(fù)能力時(shí)，則促使細(xì)胞進(jìn)入凋亡。在50％以上的人類腫瘤中存在有p53的突變，p53功能的喪失是人類腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中常見(jiàn)的分子事件。 與其他腫

3、瘤細(xì)胞不同的是，在鼻咽癌中p53基因的突變頻率很低(<10％)，且出現(xiàn)了p53蛋白積聚的現(xiàn)象。臨床樣本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p53的過(guò)表達(dá)與鼻咽癌的發(fā)病密切相關(guān)，p53的表達(dá)在鼻咽癌組織和癌旁組織中顯著的相關(guān)性提示p53的過(guò)表達(dá)出現(xiàn)在鼻咽癌癌變的早期發(fā)展階段，且隨著鼻咽癌病程的發(fā)展，p53的陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)強(qiáng)度均增加，與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移也具有一定的相關(guān)性。在構(gòu)建的LMPl轉(zhuǎn)基因小鼠中也發(fā)現(xiàn)p53的積聚現(xiàn)象。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示我們：p53在鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展

4、過(guò)程中可能具有功能活性。我們前期的研究工作發(fā)現(xiàn)病毒致瘤蛋白LMP1通過(guò)調(diào)節(jié)p53表達(dá)的增加，導(dǎo)致細(xì)胞G<,2>/M期行進(jìn)過(guò)程中重要的正性調(diào)節(jié)因子cdc2/cyclin B1復(fù)合物激酶活性下降，使其停滯于G<,2>/M期。這提示我們p53作為一個(gè)受EB病毒LMP1調(diào)控的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中具有重要的功能。除此之外，已有研究表明LMP1通過(guò)p53上調(diào)抗凋亡基因A20，Bcl-2，Survivin和△NP63抑制凋亡的發(fā)生。故LMP1

5、介導(dǎo)p53增加而不誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，LMPl通過(guò)調(diào)節(jié)p53從而穩(wěn)定EB病毒的潛伏感染，促進(jìn)上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，有助于宿主和病毒之間平衡的維持。這為我們從一個(gè)新的視野來(lái)研究和理解p53在EB病毒感染中的病理生理學(xué)意義提供了新的啟示。 一直以來(lái)，關(guān)于EB病毒轉(zhuǎn)化作用的研究都是在非鼻咽上皮來(lái)源和非上皮細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞中進(jìn)行的，EB病毒感染和其編碼的致瘤蛋白LMPl所參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究局限于腫瘤細(xì)胞中完成，不能充分闡明癌變

6、多階段演進(jìn)過(guò)程中的分子機(jī)理以及遺傳因素和環(huán)境因素在癌變過(guò)程中的相互作用關(guān)系。在國(guó)家自然科學(xué)基金委與香港研究資助局聯(lián)合科研資助基金(No.30418004)的資助下，我們引進(jìn)了體外處于癌變?cè)缙陔A段的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ推脚_(tái)：NP69、轉(zhuǎn)染了空白載體pLNSX的NP69-pLNSX和轉(zhuǎn)染了LMP1的NP69-LMPl細(xì)胞模型。因此，利用永生化的鼻咽上皮NP69細(xì)胞模型探討腫瘤的發(fā)病機(jī)理是一個(gè)很好的切入點(diǎn)。我們首先對(duì)NP69細(xì)胞模型中p53的特征進(jìn)行了研

7、究，在該模型中證實(shí)有大量游離的、野生型的p53的存在，且LMPl不僅能促進(jìn)p53的核積聚，同時(shí)還促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白水平的表達(dá)。這為我們進(jìn)一步利用該細(xì)胞模型研究致瘤蛋白LMPl調(diào)節(jié)p53功能活化的分子機(jī)制提供了重要的基礎(chǔ)。 p53翻譯后修飾是其最主要的激活機(jī)制，其中一個(gè)重要的機(jī)制是磷酸化。近年來(lái)p53磷酸化對(duì)p53的功能活化取得了新的進(jìn)展。已有將近18個(gè)p53的磷酸化位點(diǎn)得到闡明，它們分別位于p53功能結(jié)構(gòu)域的N端、核心區(qū)

8、和C末端，其中以N末端和C末端較為集中，不同的磷酸化位點(diǎn)參與p53轉(zhuǎn)錄活性、穩(wěn)定性和抗凋亡功能的調(diào)節(jié)。但病毒致瘤蛋白LMPl對(duì)p53磷酸化的調(diào)節(jié)尚不清楚。從眾多的p53磷酸化位點(diǎn)中，我們選取了N末端具有代表性的p53 Serl5、Ser20和Thr81，以及C末端的Ser392作為研究對(duì)象，來(lái)闡明p53的功能活性。 蛋白的磷酸化需要一種或多種蛋白激酶的作用。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路是由一組級(jí)聯(lián)活化的絲/蘇氨酸蛋白激

9、酶組成，主要包括ERKl/2、JNK和p38激酶通路，MAPK對(duì)于細(xì)胞周期的運(yùn)行和基因表達(dá)具有重要調(diào)控作用。已有研究表明在UV或DNA損傷等外界環(huán)境因素的刺激下，MAPK通路的活化能使p53多位點(diǎn)磷酸化。新近研究證實(shí)MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)通路在LMPl介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。因此從翻譯后修飾-磷酸化的水平來(lái)研究在LMP1的作用下p53激活的分子機(jī)制將為我們深入了解LMPl致瘤的病理生理功能提供重要的啟示。 利用NP69

10、細(xì)胞模型為材料，通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，LMP1能顯著促進(jìn)p53 Ser15、Ser 20、Ser 392和Thr 81位的磷酸化，進(jìn)一步確定LMPl主要通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)p53 Ser 15位的磷酸化；通過(guò)JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)p53Ser 20位和Thr 81位的磷酸化；通過(guò)p38信號(hào)通路調(diào)節(jié)p53 Ser 392位和Ser15位的磷酸化。其中LMP1通過(guò)JNK信號(hào)通路調(diào)節(jié)p53 Ser 20位的磷酸化程度最為顯著，而p53 Ser

11、15位的磷酸化以ERK1/2信號(hào)通路調(diào)節(jié)為主，這提示LMP1所致的JNK信號(hào)通路的激活在p53磷酸化的調(diào)控中是一條重要的信號(hào)。進(jìn)一步我們證明，LMP1所致的MAPK多條通路的異常激活導(dǎo)致p53多個(gè)位點(diǎn)的磷酸化，使p53轉(zhuǎn)錄活性增加，同時(shí)影響下游基因p21、MDM2蛋白水平的表達(dá)，促進(jìn)反式激活能力的增強(qiáng)。這些科學(xué)發(fā)現(xiàn)為闡明LMP1通過(guò)調(diào)節(jié)p53的磷酸化參與p53的功能活化提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。 p53翻譯后修飾的另一個(gè)重要機(jī)制是泛素化，細(xì)胞

12、外信號(hào)嚴(yán)格調(diào)控著目的蛋白的泛素化，而這種調(diào)控依賴于蛋白的磷酸化。蛋白的泛素化和磷酸化協(xié)同作用，相輔相成，精確調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。p53的降解是泛素化依賴性的，主要受MDM2的介導(dǎo)。MDM2具有泛素連接酶(E3)的作用。我們的研究表明，EB病毒LMPl能減少M(fèi)DM2與p53的結(jié)合能力，由此我們推測(cè)LMP1有可能通過(guò)泛素化的途徑參與p53的功能活化。 目前對(duì)泛素化的研究主要集中于Lys 48和Lys 63。與Lys 48結(jié)合的

13、多泛素鏈(Ubk48)，作為一種信號(hào)，介導(dǎo)泛素修飾底物進(jìn)入26S蛋白酶體，執(zhí)行降解功能；與Lys 63結(jié)合的多泛素鏈(Ubk63)介導(dǎo)的泛素化在DNA損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)、胞吞作用和核糖體蛋白的合成中起重要作用，而不依賴于經(jīng)典的蛋白酶體的途徑。通過(guò)本研究，我們發(fā)現(xiàn)LMPl通過(guò)MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)p53的磷酸化介導(dǎo)Ubk63泛素分子和p53的結(jié)合，尤以JNK通路介導(dǎo)的p53 Ser 20、Thr 81位的磷酸化對(duì)其泛素化的調(diào)節(jié)最為顯著，這與

14、p53的穩(wěn)定性和功能活性的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。而p53的磷酸化能抑制Ubk48與p53的結(jié)合，促進(jìn)p53穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。因此，泛素分子Ubk48和Ubk63可能通過(guò)與p53的結(jié)合，執(zhí)行不同的功能，在LMP1所致的p53中發(fā)揮重要功能。 綜上所述，本研究證實(shí)了EB病毒致瘤病毒LMPl調(diào)節(jié)p53的組成性磷酸化譜，明確了LMPl調(diào)節(jié)p53磷酸化的關(guān)鍵激酶，即MAPK信號(hào)通路，提出了工作模式圖，證明了p53是受LMPl調(diào)控的重要轉(zhuǎn)錄因子，建立了

15、LMP1→MAPK→p53的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，證明了磷酸化是調(diào)節(jié)p53轉(zhuǎn)錄活性、反式激活和穩(wěn)定性的重要修飾方式，確定了LMP1通過(guò)MAPK．信號(hào)通路調(diào)節(jié)p53磷酸化與泛素化之間的相關(guān)性。因此，本研究首次從翻譯后修飾-磷酸化和泛素化的角度闡明了EB病毒重要的致瘤蛋白LMP1調(diào)節(jié)p53的功能活性，這為闡明p53在鼻咽癌癌變過(guò)程中的重要生物學(xué)作用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為全面理解LMP1的致瘤功能提供了新的理論依據(jù)和開(kāi)拓了新的視野，最終為鼻咽癌和E