Klotho抑制EPCs衰老促進(jìn)老齡小鼠損傷動脈再內(nèi)皮化的研究.pdf

1、1.背景與目的:
　　 自從1904年德國萊比錫病理學(xué)家March,and首次提出動脈粥樣硬化(A,therosclerosis,AS)一詞以來,歷經(jīng)一個多世紀(jì),人們對AS的認(rèn)識已逐步深入。然而,目前動脈粥樣硬化發(fā)病率和致死率仍然很高,AS導(dǎo)致的心腦血管疾病仍是當(dāng)今人類死亡的首位原因之一。AS是一種退行性和增生性病變,與衰老有著密切的關(guān)系。而我國擁有世界上最龐大的老年人群,AS的遷延性和難愈性不僅嚴(yán)重危害了老年患者的健康,還導(dǎo)致

2、醫(yī)學(xué)資源連續(xù)消耗。研究衰老在AS發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制對于預(yù)防和治療AS有著重要的意義,有較大的學(xué)術(shù)價(jià)值和社會效應(yīng)。
　　 AS的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,目前認(rèn)為,血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)和功能損傷可能是動脈粥樣硬化的病理生理基礎(chǔ),內(nèi)皮損傷己被證明是AS最早期的改變,而損傷血管有效地再內(nèi)皮化可以維持血管內(nèi)皮細(xì)胞單層的完整性,預(yù)防AS的發(fā)生。目前促進(jìn)損傷血管修復(fù)的措施主要有以下幾種:戒煙等生活方式的改善;應(yīng)用藥物如他汀類藥物、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、沙坦

3、類藥物、胰島素增敏劑等抗氧化藥物保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能;血管內(nèi)皮生長因子抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡;血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)移植。
　　 以EPCs為基礎(chǔ)的細(xì)胞療法修復(fù)損傷血管已成為大家關(guān)注的方向。EPCs由造血干細(xì)胞分化而來,是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞,表達(dá)干細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)抗原,主要來源于骨髓、胎肝、臍血和脾臟。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為血管損傷后修復(fù)主要依賴于鄰近成熟內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和生長增

4、殖。而新近的研究表明骨髓和外周血中EPCs是血管內(nèi)皮損傷修復(fù)的最重要的機(jī)制之一。在血管內(nèi)皮損傷后,EPCs從骨髓中動員并歸巢于損傷血管內(nèi)皮局部,分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞,加快損傷血管再內(nèi)皮化,抑制病理性新生內(nèi)膜的形成,在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)中起著重要的作用。
　　 EPC的數(shù)量和活性受到多種生理和病理因素的影響,包括年齡、高血壓、高糖、氧化LDL、慢性腎功能衰竭等等。研究表明單純的年齡增加會使大鼠EPC動員減少,增殖、黏附和遷移能力降低,

5、并且發(fā)現(xiàn)EPCs參與損傷血管再內(nèi)皮化的過程具有年齡依賴性,即年輕供體EPCs移植促進(jìn)血管內(nèi)皮損傷再內(nèi)皮化的作用更明顯,老齡供體EPCs該效應(yīng)不明顯。衰老導(dǎo)致EPCs的功能受損、數(shù)量減少,可能是老年患者血管損傷后再內(nèi)皮化能力下降的原因。如何有效抑制EPCs衰老,促進(jìn)老年患者損傷血管有效再內(nèi)皮化成為目前急需解決的問題。
　　 Klotho(K1)基因是Kuro等在1997年發(fā)現(xiàn)的與衰老相關(guān)的新基因。K1基因在小鼠中的表達(dá)缺失導(dǎo)致類似

6、于人類衰老的各種表型變化,例如動脈內(nèi)膜增厚、中膜鈣化、動脈硬化和骨質(zhì)疏松、肺氣腫、糖和能量代謝異常等。K1基因主要在腎遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞上表達(dá)。
　　 目前,K1預(yù)防衰老的機(jī)制尚不十分清楚,有研究證實(shí)在K1基因變異的小鼠,隨著機(jī)體的逐漸衰老,骨髓、外周血EPCs數(shù)量會明顯降低,提示K1基因表達(dá)水平與EPCs關(guān)系密切。本課題擬研究小鼠增齡對K1表達(dá)的影響,探討K1對EPCs數(shù)量、生物學(xué)功能及其參與血管損傷后再內(nèi)皮化的影響,初窺K1抑

7、制EPCs衰老的可能的信號通路。
　　 2.方法:
　　 2.1小鼠增齡與K1表達(dá)水平及EPCs功能的關(guān)系
　　 2.1.1檢測不同月齡小鼠EPCs數(shù)量和功能
　　 雄性C57BL/6小鼠,按照月齡分為2月齡、12月齡、20月齡三組。采用內(nèi)皮細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化密度梯度離心法獲的小鼠骨髓源性單個核細(xì)胞,以獲得小鼠骨髓源性EPCs,并分別通過aeLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙染鑒定、流

8、式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面干細(xì)胞抗原及內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原鑒定,和用免疫組化法檢測細(xì)胞表面內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原來鑒定。分別采用acLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT分析、改良的Boyden小室、黏附細(xì)胞計(jì)數(shù)來檢測不同年齡EPCs數(shù)量、增殖、遷移和黏附能力。
　　 2.1.2檢測不同月齡小鼠腎臟K1mRNA和外周血K1蛋白水平
　　 采用RT-PCR法檢測不同月齡小鼠腎臟K1 mRNA的表達(dá),用Weste

9、rn-blot法檢測不同月齡小鼠外周血K1蛋白水平,分析不同月齡小鼠K1水平與EPCs數(shù)量及功能的相關(guān)性。
　　 2.2 K1對老齡小鼠EPCs部分生物學(xué)功能的影響
　　 2.2.1觀察K1對體外培養(yǎng)的老齡小鼠EPCs部分生物學(xué)功能的影響
　　 20月齡小鼠骨髓源性EPCs與不同濃度的K1蛋白孵育,分別采用acLDL-DiI和FITC-UEA-I熒光雙陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT分析和改良的Boyden小室法來檢測其數(shù)量

10、、增殖、遷移能力的變化。
　　 2.2.2初步探討K1抑制EPCs衰老的可能的信號通路
　　 采用Western-blot法檢測不同濃度K1孵育老齡小鼠p53、p21的表達(dá)和Akt的磷酸化水平,分析K1影響EPCs衰老的機(jī)制。
　　 2.3 K1促進(jìn)老齡小鼠損傷血管再內(nèi)皮化的研究
　　 主要觀察K1對老齡小鼠血管損傷后EPCs動員及修復(fù)損傷內(nèi)皮的影響。采用非顯微外科法建立小鼠(20月齡)頸動脈損傷模型。在

11、小鼠頸動脈損傷后各時(shí)點(diǎn)(術(shù)前、術(shù)后1天、術(shù)后3天、術(shù)后7天和術(shù)后14天)獲取外周血,采用流式細(xì)胞儀檢測外周血EPCs數(shù)量。在小鼠頸動脈損傷后第3天,采用流式細(xì)胞儀檢測K1處理組、K1抗體處理組外周血EPCs的數(shù)量;14天后通過Evans blue染色檢測損傷動脈再內(nèi)皮化情況,通過HE染色檢測損傷動脈新生內(nèi)膜增生情況。
　　 3.結(jié)果
　　 第一部分:培養(yǎng)7天的小鼠骨髓單個核細(xì)胞呈梭形或紡錘狀,與內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)相似,絕大多數(shù)

12、細(xì)胞可攝取acLDL-DiI和與UEA-I結(jié)合,流式細(xì)胞儀檢測顯示這些細(xì)胞既有干細(xì)胞抗原Sca-1的高表達(dá),又有內(nèi)皮特異性標(biāo)記物VEGFR-2的高表達(dá),免疫組化檢測顯示這些細(xì)胞還高表達(dá)內(nèi)皮特異性標(biāo)記物vWF。熒光雙染計(jì)數(shù)2M、12M、20M月齡小鼠EPCs數(shù)量,發(fā)現(xiàn)隨著月齡的增加,EPCs數(shù)量明顯減少。采用MTT法檢測不同月齡小鼠骨髓源性EPCs增殖能力,用Boyden遷移小室法測定其遷移能力,用粘附細(xì)胞計(jì)數(shù)測量其粘附能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨

13、著月齡的增加,小鼠骨髓源性EPCs的粘附功能、遷移功能、增殖功能明顯下降。分別采用RT-PCR和Western-blot法檢測不同月齡小鼠腎臟K1mRNA和外周血K1蛋白水平,結(jié)果顯示K1mRNA和外周血K1蛋白水平隨著月齡的增加而顯著性降低。同時(shí)分析顯示K1水平與EPCs的數(shù)量和粘附功能、遷移功能和增殖功能具有相關(guān)性。
　　 第二部分:體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,熒光雙染計(jì)數(shù)顯示,K1刺激濃度依賴性增加老齡小鼠骨髓單個核細(xì)胞分化成EP

14、Cs的數(shù)量;MTT分析顯示,K1刺激濃度依賴性增強(qiáng)EPCs的增殖能力;改良的Boyden小室分析顯示,K1濃度依賴性增加遷移的EPCs數(shù)量。
　　 采用Western-blot法測定不同濃度的K1蛋白處理后的EPCs細(xì)胞的p53/p21表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)p53/p21呈K1蛋白濃度依賴性下降;以P-Akt與Akt的比值來代表EPCs Akt磷酸化的水平,發(fā)現(xiàn)Akt的磷酸化水平隨著K1蛋白濃度的增加而逐漸下降。
　　 第三部分

15、:非顯微外科手術(shù)方法損傷小鼠頸動脈后,取損傷動脈Evans blue染色觀察,損傷動脈內(nèi)皮完全剝脫。小鼠頸動脈損傷后,采用流式細(xì)胞儀檢測外周血EPCs數(shù)量顯示,小鼠頸動脈損傷后1天、3天和7天,外周血EPCs數(shù)量明顯高于假手術(shù)組,外周血EPCs數(shù)量在動脈損傷后3天達(dá)到高峰。采集術(shù)后第3天K1處理組和K1抗體處理組小鼠的外周血,檢測其EPCs數(shù)量,結(jié)果顯示:與頸動脈損傷組相比較,K1處理組的循環(huán)K1明顯升高,而K1抗體處理組無明顯上升。術(shù)

16、后第14天,損傷血管Evans blue染色顯示,在K1處理組,損傷血管再內(nèi)皮化的面積明顯高于對照頸動脈損傷組,K1抗體處理組的再內(nèi)皮化的面積與頸動脈損傷組相比無明顯差異。HE染色后應(yīng)用Image ProPlus軟件用來測量新生內(nèi)膜、中膜面積,利用內(nèi)膜面積和中膜面積的比值來評價(jià)內(nèi)膜新生,結(jié)果顯示,K1處理組內(nèi)膜增生程度較對照組及K1抗體處理組明顯降低。
　　 4.結(jié)論
　　 4.1不同月齡小鼠腎臟K1 mRNA表達(dá)、外周

17、血K1蛋白水平與EPCs的數(shù)量、遷移、增殖、黏附功能相關(guān),且隨小鼠月齡的增加下降;
　　 4.2在本研究濃度范圍內(nèi),K1蛋白可能參與體外培養(yǎng)的老齡小鼠骨髓單個核細(xì)胞分化,促進(jìn)骨髓單個核細(xì)胞分化成為EPCs,呈濃度依賴性提高其遷移能力和增殖能力;
　　 4.3在本研究濃度范圍內(nèi),K1蛋白可濃度依賴性降低體外培養(yǎng)的EPCs的p53/p21的表達(dá)以及Akt的磷酸化水平,可能部分通過下調(diào)Akt活性,降低p53/p21水平,抑制細(xì)