PDTC抗冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧再給氧損傷的實驗研究.pdf

1、目的:體外培養(yǎng)豬冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(pofine coronary artefies endothelial cell,PCAEC)，建立缺氧再給氧(hypoxia／reoxygenation,H／R)模型，觀察H／R及抗氧化劑吡咯烷二硫氨基甲酸脂(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)對PCAEC形態(tài)及丙二醛(malo naldehyde,MDA)、谷胱甘肽(glutathione,GSH)等含量的影響，觀察

2、H／R及PDTC對PCAEC核因子-kB P65(nuclear factor kappa-B，NF-kB P65)活性及細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)表達(dá)的影響，觀察H／R及PDTC對PCAEC細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率的影響，探討PCAEC缺氧再給氧損傷的發(fā)生機(jī)制及PDTC對該病理生理過程的影響。 方法: 1.取豬冠狀動脈，分離脂肪及結(jié)締組織，采用酶消

3、化法分離細(xì)胞作原代培養(yǎng)，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及DiI-Ac-LDL染色鑒定細(xì)胞。取第3-5代PCAEC用于實驗。 2.將PCAECs分為三組，對照組：未經(jīng)處理。H／R組：將細(xì)胞放置低氧環(huán)境(95％N<,2>，5％CO<,2>)37℃培養(yǎng)2h，再恢復(fù)正常環(huán)境(21％O<,2>，74％N<,2>，5％CO<,2>)37℃培養(yǎng)。PDTC組：以100umol／L的PDTC與PCAEC共同孵育1h，再制作H／R模型。 3.倒

4、置相差顯微鏡觀察各組PCAEC形態(tài)學(xué)變化；應(yīng)用二硫代硝基苯甲酸比色法及硫代巴比妥酸比色法分別測定PCAEC缺氧2h、再給氧3h時MDA及GSH等物質(zhì)含量；應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法測定各組細(xì)胞缺氧2h、再給氧3h、再給氧15h時NF-KB P65及ICAM-1的表達(dá)；MTT比色法檢測缺氧2h、再給氧3h時PCAEC活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測缺氧2h、再給氧3h時細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果: 1.倒置相差顯微鏡下PCAEC單層貼壁生長，呈典型

5、的鋪路石樣結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間連接緊密；DiI-Ac-LDL染色，在熒光顯微鏡下顯示特征性的黃綠色熒光，細(xì)胞純度大于98％。 2.細(xì)胞形態(tài)觀察 對照組PCAEC呈單層鋪路石樣生長，細(xì)胞間連接緊密，在兩個時間點細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。H/R組缺氧2h，部分細(xì)胞變圓收縮，細(xì)胞間隙增寬；再給氧3h大部分細(xì)胞變圓收縮，細(xì)胞間隙明顯增寬，部分細(xì)胞脫落。PDTC組缺氧2h，大部分細(xì)胞貼壁生長，但細(xì)胞間隙較寬，少部分細(xì)胞變圓收縮；再給氧3h較缺氧2h細(xì)

6、胞形態(tài)無明顯改變，但個別細(xì)胞脫落。提示：缺氧改變PCAEC的正常形態(tài)，再給氧可使細(xì)胞更嚴(yán)重的變形，甚至使細(xì)胞脫落、死亡；PDTC可減輕上述改變。 3. MDA及GSH的含量缺氧2h和再給氧3h時H/R組及PDTC組MDA含量較對照組同期明顯升高(P＜0.05)，其中PDTC組明顯低于H/R組同期(P＜0.05)；H/R組及PDTC組組內(nèi)比較再給氧3h時MDA含量明顯高于缺氧2h(P＜0.05)，而對照組兩時間點MDA含量比較無明

7、顯變化(P＞0.1)。缺氧2h和再給氧3h時H/R組及PDTC組GSH含量明顯低于對照組同期(P＜0.05)，其中PDTC組明顯高于H/R組同期(P＜0.05)；H/R組及PDTC組組內(nèi)比較再給氧3h時GSH含量明顯低于缺氧2h(P＜0.05)，而對照組兩時間點GSH含量比較無明顯變化(P＞0.1)。提示：缺氧使PCAEC的氧自由基清除功能減退，再給氧進(jìn)一步加重此種損害；PDTC可減輕缺氧再給氧引起的損害。 4.NF-κB P6

8、5及ICAM-1的表達(dá)在三個時間點，對照組中NF-κB P65有一定程度的表達(dá)；H／R組及PDTC組NF-κ B P65在缺氧2h表達(dá)明顯增強(qiáng)，再給氧3h表達(dá)達(dá)峰值，以后逐漸回落，但陽性細(xì)胞率仍明顯高于對照組同期(P＜0.05)，其中 PDTC組陽性細(xì)胞率明顯低于HJR組同期(P＜0.05)；H／R組及PDTC組組內(nèi)比較再給氧3h、15h明顯高于缺氧2h(P＜0.05)，而對照組各時間點比較無明顯變化(P>0.1)。在三個時間點對照組中

9、ICAM-1持續(xù)低強(qiáng)度表達(dá)；H／R組及PDTC組在缺氧2h時：ICAM-1表達(dá)開始增強(qiáng)、再給氧3h表達(dá)明顯增強(qiáng)，15小時達(dá)峰值，其表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對照組同期(P＜0.05)；其中PDTC組ICAM-1表達(dá)程度明顯低于H／R組同期(P＜0.05)；H／R組及PDTC組組內(nèi)比較再給氧15 h明顯高于缺氧2h(P＜0.05)，而對照組兩時間點比較無明顯變化(P>0.1)。提示：缺氧再給氧使NF-K B、ICAM-1表達(dá)明顯增加，而NF-kB活

10、性明顯增強(qiáng)與ICAM-1表達(dá)明顯增多可能是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要因素；PDTC可有效地抑制NF-K B、ICAM-1表達(dá)，減輕缺氧再給氧引起的損害。 5.MTT 測定H／R組及PDTC組在缺氧2h、再給氧3h細(xì)胞活性明顯低于對照組同期(P＜0.05)，其中PDTC組細(xì)胞活性明顯高于H／R組(P<0.05)；H／R組及PDTC組組內(nèi)比較再給氧3h明顯低于缺氧2h(P＜0.05)，而對照組兩時間點細(xì)胞活性比較無明顯變化(P>0.1)。提

11、示：缺氧損害。PCAEC活性，再給氧可加重細(xì)胞活性的損害；PDTC可特異性抑制NF-K B及ICAM-1表達(dá)，減輕缺氧再給氧引起的細(xì)胞損害。 6.細(xì)胞凋亡檢測H/R 組及PDTC組在缺氧2h、再給氧3h細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組同期(P<0.05)，其中PDTC組細(xì)胞凋亡率明顯低于H/R組同期(P＜0.05)：H／R組及PDTC組組內(nèi)比較再給氧3h細(xì)胞凋亡率明顯高于缺氧2h(P<0.05)，而對照組兩時間點細(xì)胞凋亡率比較無明顯變化

12、(P>0.1)。提示：缺氧可誘導(dǎo)PCAEC凋亡，再給氧可使細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步增加；PDTC通過特異性抑制NF-K B及ICAM-1表達(dá)，可降低缺氧再給氧引起的細(xì)胞凋亡。 結(jié)論: 1.缺氧損害PCAEC的正常形態(tài)，再給氧可使細(xì)胞產(chǎn)生更嚴(yán)重變形； 2.缺氧使PCAEC的氧自由基清除功能減退，再給氧進(jìn)一步加重此種損害； 3.H／R 使NF-K B、ICAM-1表達(dá)明顯增加，而NF-kB活性明顯增強(qiáng)與ICAM-1