雙功能分子hIL-2-mGM-CSF蛋白的改建、表達(dá)、純化及功能的初步研究.pdf

1、第一軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文雙功能分子hIL2mGMCSF蛋白的改建、表達(dá)、純化及功能的初步研究姓名：溫茜申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：分子免疫學(xué)指導(dǎo)教師：王小寧馬驪20060520摘要應(yīng)細(xì)胞增殖活化，另一方面可增加細(xì)胞毒性T細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合的幾率，增強(qiáng)特異性殺傷，有效促進(jìn)機(jī)體系統(tǒng)性抗腫瘤的效應(yīng)。為了驗(yàn)證這一設(shè)想，我們?cè)诙嗄甑墓ぷ骰A(chǔ)上針對(duì)hIL_2／瞄M_CSF融合蛋白開(kāi)展了本研究。本研究主要以性質(zhì)最簡(jiǎn)單的絲氨酸和甘氨酸為連接肽的基本組成成分，

2、設(shè)計(jì)出7個(gè)長(zhǎng)度和親水性不同的連接肽，并利用數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析了連接肽和雙功能分子的基本理化性質(zhì)。根據(jù)重疊延伸剪接術(shù)(genesplicingbyoverlapextension，SOE)原理，成功構(gòu)建具有不同連接肽的pET一1lc／hlL一2／mGM—CSF表達(dá)載體共6個(gè)。蛋白的羧基端引入了6His標(biāo)簽，使蛋白可用金屬離子親和層析方法進(jìn)行純化，為后續(xù)的蛋白純化提供了便利。根據(jù)連接肽的性質(zhì)，本研究選擇了長(zhǎng)度和疏水性適中的一個(gè)連接肽，首先對(duì)hl

3、L2一mGMCSF／pET—llc／BL21工程菌的表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，采用THbroth培養(yǎng)基，經(jīng)42℃，03mol／LIPTG誘導(dǎo)，目的蛋白表達(dá)量達(dá)菌體總蛋白的30％以上，以包涵體形式存在。包涵體必須利用強(qiáng)變性劑使其中的目標(biāo)蛋白充分變性溶解，進(jìn)行復(fù)性后，才能獲得有活性的目標(biāo)蛋白，然而，復(fù)性過(guò)程中大部分產(chǎn)物會(huì)聚合析出，即所謂的“看得見(jiàn)，拿不到”，是目前基因工程產(chǎn)品生產(chǎn)的一個(gè)瓶頸問(wèn)題。利用本所發(fā)明的專利方法粗提的包涵體蛋白用8m

4、ol／L尿素變性液溶解，取蛋白上清在變性狀態(tài)下親和層析純化后，用lOmmol／LHCl對(duì)純化樣品透析，再采用等容超濾方法復(fù)性，使蛋白緩慢地從還原性的變性環(huán)境過(guò)渡到氧化性的復(fù)性環(huán)境中，在此過(guò)程中蛋白得以正確折疊，形成正確的構(gòu)象。復(fù)性后蛋白只需陰離子層析一步純化，就得到純度約為90％的融合蛋白，其hlL2一端的比活為87106U／mg，mGMCSF一端的比活為11i07U／mg。這一純化復(fù)性路線成功得到了高活性的hlL一2／IIlGM—CS

5、F融合蚩白。通過(guò)間接免疫熒光試驗(yàn)，活體熒光染色結(jié)合試驗(yàn)和體外殺傷試驗(yàn)證實(shí)：hlL一2／mGM—CSF融合蛋白能結(jié)合到IL一2受體陽(yáng)性的細(xì)胞表面，也能結(jié)合到GMCSF受體陽(yáng)性的細(xì)胞表面。激光共聚焦顯微鏡觀察到，共孵育時(shí)這兩類細(xì)胞可借助融合蛋白而相互結(jié)合。初步的體外殺傷試驗(yàn)提示IL一2／GMCSF融合蛋白可在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的效應(yīng)階段促進(jìn)殺傷效應(yīng)。目前尚無(wú)充分證據(jù)證明這一融合蛋白能充分活化初始T細(xì)胞，使其增殖分化而發(fā)揮特異性的殺