鐵結(jié)合蛋白、鐵調(diào)素及MnSOD的表達(dá)、純化和功能研究.pdf

1、1.鐵結(jié)合蛋白
　　 鐵結(jié)合蛋白(ferric-ion binding protein,Fbp)是革蘭氏陰性菌表達(dá)的含有309個(gè)氨基酸的蛋白,它位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),是致病菌獲取鐵的主要蛋白。它通過一個(gè)組氨酸(His9)、一個(gè)谷氨酸(Glu57)和兩個(gè)酪氨酸(Tyr195、Tyr196)與Fe3+結(jié)合,另有一個(gè)磷酸根作為協(xié)同陰離子,一個(gè)水分子作為第六個(gè)配體,將Fe3+跨過胞質(zhì)運(yùn)送到細(xì)胞質(zhì)膜。研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)酪氨酸是Fbp結(jié)合Fe3+關(guān)鍵位點(diǎn)

2、,而協(xié)同陰離子的參與也很重要。
　　 本論文為考察酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)對(duì)Fbp結(jié)合Fe3+的能力的影響,表達(dá)、純化了單突變體蛋白Y195F、Y196F和雙突變體蛋白Y195F/Y196F,利用紫外-可見光譜研究了Fe(NTA)與Y195F間的作用,發(fā)現(xiàn)holo-Fbp中的特征吸收峰從481nm紅移到468nm,表明反應(yīng)形成了Fe-Y195F-NTA三元絡(luò)合物,NTA是協(xié)同陰離子,每個(gè)突變體蛋白平均結(jié)合約0.5個(gè)Fe3+。滴定實(shí)驗(yàn)測(cè)得表

3、觀結(jié)合常數(shù)為3.1×104L·mol-1(10mmol·L-1 Hepes緩沖溶液,pH7.4,298K)。
　　 實(shí)驗(yàn)室前期研究和一些文獻(xiàn)報(bào)道還發(fā)現(xiàn)Fbp具有催化磷酸酯水解的功能,為研究該催化反應(yīng)的機(jī)制,我們將apo-Fbp及其突變體Y195F、Y196F在10mmol·L-1 Hepes緩沖溶液中293K下與PPi反應(yīng),發(fā)現(xiàn)pH6.5、7.5、8.5時(shí),Y196F催化磷酸鍵的斷裂的速率常數(shù)分別為1.05 mmol·L-1·h

4、-1、1.11 mmol·L-1·h-1、1.22×10-2 mmol·L-1·h-1,與apo-Fbp催化磷酸鍵水解的能力相近,但相應(yīng)pH下,Y195F比apo-Fbp弱約10倍。同時(shí),Dotblot試驗(yàn)(nc膜,磷酸根-酪氨酸抗體為一抗,驢抗鼠二抗)顯示,apo-Fbp、Y195F、Y196F與PPi的反應(yīng)產(chǎn)物都結(jié)合了磷酸根,但雙突變體Y195F/Y196F不能結(jié)合磷酸根,證實(shí)Fbp催化焦磷酸水解的機(jī)制是主要通過Fbp中的鐵的結(jié)合位

5、點(diǎn)Tyr195的磷酸化來進(jìn)行的。
　　 2.鐵調(diào)素
　　 鐵調(diào)素(hepcidin,HEP)是由肝細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)細(xì)胞中鐵的代謝平衡的激素肽。它含有25個(gè)氨基酸殘基并且富含半胱氨酸,受細(xì)胞中鐵濃度和感染正調(diào)控,而受貧血和缺氧負(fù)調(diào)控,它與血沉癥、神經(jīng)退行性疾病等鐵蓄積相關(guān)疾病密切相關(guān)。
　　 本論文通過克隆將hepcidin-25 cDNA與載體pMal-C2X連接,構(gòu)建了表達(dá)體系,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 DE3表

6、達(dá)融合蛋白MBP-hepcidin-25。經(jīng)過層析柱分離后獲得了一個(gè)分子量為46000Da的可溶性蛋白,通過TEV消化酶等酶進(jìn)行酶切有望獲得HEP-25單體,為研究HEP調(diào)控細(xì)胞鐵代謝的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.錳超氧化物歧化酶
　　 錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)是真核細(xì)胞的線粒體中表達(dá)的一種重要的抗氧化酶,通過催化超氧化離子自由基O2-的歧化反應(yīng)保護(hù)