鐵結(jié)合蛋白在抗菌藥物研究中的應(yīng)用.pdf

1、鐵是生物體必需的微量元素。人體血液中的Fe3+嚴格調(diào)控在約10-18mol·L-1,對于需鐵的細菌來說,維持其生長的Fe3+的最低濃度約為10-7mol·L-1～10-5mol·L-1,而Fe3+的獲得,不僅影響其生長、繁殖,而且影響其致病能力。因此,細菌進化出有效地從宿主體內(nèi)獲取Fe3+的機制,主要包括鐵的運載體(siderophores)系統(tǒng)、鐵/亞鐵血紅素系統(tǒng)、轉(zhuǎn)鐵蛋白接受子-鐵結(jié)合蛋白系統(tǒng)。鐵結(jié)合蛋白(ferric-iron b

2、inding protain,FBP)主要存在于在淋病奈瑟雙球菌、膜炎奈瑟雙球菌、流行感冒嗜血桿菌、伴放線放線桿菌以及溶血性巴氏桿菌等等。其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)具有高度保守性,是唯一的一種在這些細菌細胞周質(zhì)中負責(zé)傳遞Fe3+的蛋白。 鐵結(jié)合蛋白也被稱為細菌的轉(zhuǎn)鐵蛋白,是因為它的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)鐵蛋白非常相似,屬于一個蛋白家族。最近對流感嗜血桿菌中的鐵結(jié)合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的研究揭示了它與轉(zhuǎn)鐵蛋白一個裂片在結(jié)構(gòu)上有同源性但在核苷酸序列沒有同源性。

3、因此,鐵結(jié)合蛋白對細菌很重要,可以作為研究新型抗菌藥物的靶點。 本課題以從大腸桿菌表達出淋病奈瑟雙球菌中的鐵結(jié)合蛋白為研究對象,研究了環(huán)丙沙星、天冬氨酸環(huán)丙沙星、頭孢曲松鈉、硝酸銅及環(huán)丙沙星-銅的配合物與鐵結(jié)合蛋白的作用。 在10 mmol·L-1、pH 7.4Tris-Cl緩沖溶液中,298 K時,向鐵結(jié)合蛋白(iron-loaded FBP,holo-FBP)中加入環(huán)丙沙星溶液,環(huán)丙沙星與Fe3+形成配合物而將Fe3

4、+從holo-FBP中脫去,當環(huán)丙沙星過量50倍時,可移去holo-FBP中一半量的Fe3+。 將環(huán)丙沙星水溶液與天冬氨酸水溶液按物質(zhì)的量等比例混合,在343K反應(yīng)1小時,形成天冬氨酸環(huán)丙沙星。天冬氨酸環(huán)丙沙星與holo-FBP在上述。Tris-Cl緩沖溶液中反應(yīng),導(dǎo)致holo-FBP中Fe3+-蛋白的MLCT吸收峰的強度上升。相似的,頭孢曲松鈉也導(dǎo)致holo-FBP中Fe3+-蛋白的MLCT吸收峰的強度上升。這種現(xiàn)象可能是由于

5、這兩個分子結(jié)合在holo-FBP中Fe3+所引起的。但天冬氨酸卻可將Fe3+從holo-FBP中脫去。 在10 mmol·L-1、pH 7.4Tris-Cl緩沖溶液中,298 K時,向脫鐵鐵結(jié)合蛋白(unloaded FBP,apo-FBP)中加入Cu(NO3)2溶液,紫外-可見光譜顯示Cu2+能結(jié)合于蛋白中金屬離子的特征結(jié)合位點,且反應(yīng)在混合時間內(nèi)完成。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法分析結(jié)果表明,Cu2+與apo-FBP的飽和

6、結(jié)合計量比為1:1。當銅與蛋白的濃度比分別為2:1,10:1,50:1時,蛋白可分別結(jié)合0.52、0.40、1.20 Cu2+。在不加其它協(xié)同陰離子的條件下,對滴定數(shù)據(jù)的線性擬合給出Cu2+與apo-FBP的結(jié)合常數(shù)為(3.34±0.16)×103L·mol-1。碳酸根陰離子對硝酸銅和鐵結(jié)合蛋白反應(yīng)的協(xié)同效應(yīng)大于磷酸根、硫酸根。 將環(huán)丙沙星與硫酸銅按物質(zhì)的量1:1混合,在343K反應(yīng)2小時,形成環(huán)丙沙星.銅配合物,X-射線衍射法

7、分析,確定其組成為[Cu(CIP)(H2O)3]SO4·2H2O,空間群為P2(1)/c,a=14.798(4)A,b=14.966(4)A,c=10.506(3)A,a=90.00°,β=92.966(4)°,γ=90.00°。其中Cu2+配位數(shù)為5,三個配位氧原子來自水分子,兩個配位氧原子分別來自環(huán)丙沙星上的羧酸根和酮基。將環(huán)丙沙星.銅配合物與apo-FBP在上述Tris-Cl緩沖溶液中反應(yīng),紫外-可見光譜顯示Cu2+同樣可鍵合于F

8、BP中Fe3+的結(jié)合位點,且反應(yīng)在混合時間內(nèi)完成。其中,環(huán)丙沙星可能以協(xié)同陰離子的形式仍結(jié)合于Cu2+上。 通過對實驗結(jié)果進行分析,發(fā)現(xiàn)抗菌藥物及其它化合物的結(jié)構(gòu)對其與鐵結(jié)合蛋白的作用影響很大,當其結(jié)構(gòu)中存在一元羧酸且其鄰近的位置(β-、γ-C上)存在酮基(或羧基)時,它們可通過與Fe3+形成配合物而將Fe3+從holo-FBP中脫去,如環(huán)丙沙星、天冬氨酸；當結(jié)構(gòu)中再增加一個或多個酮基(或羧基)時,它們可通過增加的酮基(或羧基)