大腸桿菌和人IscA蛋白體內(nèi)外鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究.pdf

1、目的：
　　 為研究大腸桿菌和人類IscA蛋白在體內(nèi)的鐵結(jié)合活性以及在鐵硫簇合成過(guò)程中發(fā)揮的作用，在大腸桿菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，在M9培養(yǎng)基中添加和不添加外源鐵，純化后比較兩者鐵結(jié)合情況；并且在有氧和無(wú)氧條件下比較大腸桿菌IscA鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的差異，從而較全面地闡述大腸桿菌和人類IscA的生理功能。
　　 方法：
　　 1．大腸桿菌IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)大腸桿菌I

2、scA體內(nèi)鐵結(jié)合活性
　　 將構(gòu)建好的pET28b-E.coliIscA、pET28b-E.coliIscU、pET28b-E.coliSufA、pET28b-E.coliCyay表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中，在添加和不添加外源鐵的M9培養(yǎng)基中用IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。通過(guò)鎳柱親和層析純化目的蛋白并用紫外分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描蛋白樣品，比較鐵結(jié)合情況。為進(jìn)一步證明大腸桿菌IscA體內(nèi)結(jié)合鐵活力，不同濃度外源鐵添加入M9培養(yǎng)

3、基中，用EPR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自由鐵的相對(duì)濃度，并在同樣實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定體內(nèi)表達(dá)的IscA的鐵結(jié)合含量。
　　 2)氧化還原條件對(duì)大腸桿菌IscA體內(nèi)外結(jié)合鐵活性的影響在無(wú)氧和有氧條件下，分別在添加有2μM外源鐵的M9培養(yǎng)基中表達(dá)和純化大腸桿菌IscA和SufA，比較有氧和無(wú)氧時(shí)體內(nèi)鐵結(jié)合含量差異。利用純化的無(wú)鐵IscA在無(wú)氧和有氧條件下體外與鐵進(jìn)行結(jié)合，比較差異。并進(jìn)一步闡明在氧化和還原狀態(tài)下IscA鐵結(jié)合活性的差異。
　　

4、 3)大腸桿菌IscA在體外有氧和無(wú)氧條件對(duì)鐵硫簇合成的不同作用分別在無(wú)氧或者有氧條件下，用游離二價(jià)鐵或者結(jié)合到IscA上的重組鐵，在IscS、IscU、L-半胱氨酸存在的體系中孵育，并用紫外分光光度計(jì)掃描反應(yīng)體系，監(jiān)測(cè)IscU上的鐵硫簇的體外組合情況。
　　 2．人IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)人IscA在大腸桿菌體內(nèi)鐵結(jié)合活性
　　 將構(gòu)建好的pET28b-hIscA1、pET28b-

5、humanFrataxin轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中，在添加或者不添加外源鐵的M9培養(yǎng)基中用IPTG分別誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。利用上述研究大腸桿菌IscA體內(nèi)鐵結(jié)合活性一樣的方法，分別比較其體內(nèi)鐵結(jié)合活性。
　　 2)人IscA對(duì)大腸桿菌體內(nèi)外鐵硫簇合成的替代作用用含有飽和鐵的人IscA蛋白和大腸桿菌IscS、IscU和L-半胱氨酸同時(shí)孵育，并用紫外分光光度計(jì)掃描反應(yīng)體系，監(jiān)測(cè)IscU上的鐵硫簇的體外組合情況。另外將構(gòu)建好的pBAD-h

6、IscA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌IscA-/SufA-基因雙敲除菌株中，用低濃度L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，觀察菌株生長(zhǎng)狀態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1．大腸桿菌IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)大腸桿菌IscA體內(nèi)鐵結(jié)合活性在不加鐵的M9培養(yǎng)基表達(dá)純化出來(lái)的大腸桿菌IscA和同源蛋白SufA含有數(shù)量可忽略不計(jì)的鐵；在添加有外源鐵的培養(yǎng)基中表達(dá)純化出來(lái)的大腸桿菌IscA和SufA在315nm處有一個(gè)較高的特異性吸

7、收峰，表明結(jié)合了相當(dāng)數(shù)量的鐵；但是在同樣實(shí)驗(yàn)條件下，大腸桿菌IscU、Cyay不能結(jié)合鐵。在添加不同鐵濃度的M9培養(yǎng)基中純化出來(lái)的IscA在315nm處的鐵結(jié)合峰的高度呈現(xiàn)飽和滴定曲線，和細(xì)胞內(nèi)自由鐵含量滴定曲線相一致。
　　 2)氧化還原條件對(duì)大腸桿菌IscA體內(nèi)外結(jié)合鐵活性的影響在無(wú)氧條件下，IscA體內(nèi)外結(jié)合鐵的活性都顯著下降。對(duì)IscA的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，二價(jià)鐵只有被氧化成三價(jià)鐵才能結(jié)合IscA，而和IscA結(jié)合的三價(jià)鐵被

8、還原成二價(jià)鐵后與IscA分離。
　　 3)大腸桿菌IscA在體外有氧和無(wú)氧條件對(duì)鐵硫簇合成的不同作用游離二價(jià)鐵暴露在空氣中3h即被完全氧化成三價(jià)鐵，并生成氫氧化三鐵沉淀，不能參與體外鐵硫簇的合成。而與IscA結(jié)合的鐵能夠在同樣條件下穩(wěn)定存在并提供給鐵硫簇合成。無(wú)氧條件下兩者無(wú)明顯差別。
　　 2．人IscA蛋白鐵結(jié)合活性和鐵硫簇合成的研究
　　 1)人IscA在大腸桿菌體內(nèi)鐵結(jié)合活性同大腸桿菌IscA類似，在不加

9、鐵的M9培養(yǎng)基表達(dá)純化出來(lái)的人IscA含有極微量的鐵；在添加有外源鐵的培養(yǎng)基中表達(dá)純化出來(lái)的人IscA在315nm處有一個(gè)較高的特異性鐵結(jié)合峰。
　　 2)人IscA對(duì)大腸桿菌體內(nèi)外鐵硫簇合成的替代作用結(jié)合鐵的人IscA在體外可以為大腸桿菌鐵硫簇合成系統(tǒng)提供鐵并合成鐵硫簇。而且人IscA基因的導(dǎo)入和誘導(dǎo)表達(dá)，可以使原本不能在M9培養(yǎng)基上存活的大腸桿菌IscA-/SufA-基因雙敲除菌株恢復(fù)緩慢生長(zhǎng)。
　　 結(jié)論：