大腸桿菌IscA和SufA在鐵硫簇生物合成中的功能研究.pdf

1、目的： 為研究大腸桿菌中IscA和SufA蛋白的功能，通過同源重組技術(shù)敲除大腸桿菌中編碼這兩個(gè)蛋白的基因iscA和sufA，得到基因缺失的雙突變株，再將這兩個(gè)基因分別導(dǎo)入雙突變株中，同時(shí)運(yùn)用定點(diǎn)突變技術(shù)將這兩個(gè)蛋白上已發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)功能關(guān)鍵位點(diǎn)定點(diǎn)突變，測(cè)定這些構(gòu)建菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)，為這兩個(gè)蛋白的功能研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.大腸桿菌iscA-sufA-雙突變株的構(gòu)建 1)打靶載體的制備根據(jù)哈佛大學(xué)網(wǎng)站提

2、供的基因敲除的引物序列，送大連寶生物公司合成，通過兩步交叉PCR反應(yīng)，擴(kuò)增出兩個(gè)基因的讀碼框缺失片段iscA-和sufA-，克隆到低拷貝、條件復(fù)制基因敲除質(zhì)粒工具pKOV內(nèi)的NotI、，SalI雙酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建兩個(gè)基因打靶載體：pKOV-iscA-和pKOV-sufA-。 2)iscA和sufA單個(gè)基因的敲除利用已構(gòu)建好的打靶載體pKOV-iscA-、pKOV-sufA-進(jìn)行iscA基因和sufA基因的敲除。其敲除流程是：a)

3、使用質(zhì)粒小量提取試劑盒，從含有打靶載體pKOV-iscA-和pKOV-sufA-的大腸桿菌DH5a中提取純度較高的打靶載體pKOV-iscA-和pKOV-sufA-；b)通過冷氯化鈣法轉(zhuǎn)化重組頻繁的大腸桿菌株MC4100；c)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布于氯霉素/LB平板并置42℃孵育，平板上存活的菌落表明重組pKOV質(zhì)粒已成功整合進(jìn)入基因組DNA，因?yàn)橛坞x質(zhì)粒不會(huì)在非允許溫度下復(fù)制增殖；d)存活的菌落立即被置于含5％(w/v)蔗糖的LB平板

4、上置30℃培養(yǎng)以選擇發(fā)生第二次重組的大腸桿菌克隆。對(duì)蔗糖抵抗且對(duì)氯霉素敏感的細(xì)菌克隆被挑選用作進(jìn)一步分析，所選克隆通過針對(duì)目的基因iscA和sufA兩側(cè)序列引物的PCR方法進(jìn)行篩選，如果敲除成功，PCR擴(kuò)增出不含基因iscA和sufA讀框的片段，相反，擴(kuò)增出象親代一樣的片段，證實(shí)敲除不成功。 3)iscA和sufA兩個(gè)基因的敲除通過同樣的敲除流程，在iscA突變株基礎(chǔ)上敲除sufA，得到iscA和sufA兩個(gè)基因缺失的突變株is

5、cA-sufA-。其中，敲除流程和原來不同之處是：第二次同源重組條件改為，含5％(w/v)蔗糖的LB平板置30℃厭氧培養(yǎng)，其它條件不變。 2.iscA和sufA基因的導(dǎo)入 以野生型大腸桿菌MC4100的基因組為模板，用PCR方法分別擴(kuò)增出iscA和sufA基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ，EcoRⅠ酶切后克隆入表達(dá)載體pBAD構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD-iscA和pBAD-sufA。將重組質(zhì)粒pBAD-iscA和pBAD

6、-sufA分別轉(zhuǎn)化入iscA-sufA-雙突變株，構(gòu)建菌株pBAD-IscA/iscA-sufA-和pBAD-SufA/iscA-sufA-。 3.iscA和sufA基因的定點(diǎn)突變 以野生型大腸桿菌MC4100的基因組作為模板，經(jīng)PCR分別擴(kuò)增出定點(diǎn)突變的DNA片段iscA35，icsA99，iscA101和sufA50，sufA114，sufA116，分別含有IscA-C35S，IscA-C99S，IscA-C101S

7、和SufA-C50S，SufA-C114S，SufA-C116S相應(yīng)位點(diǎn)上的突變。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ，EcoRⅠ酶切后克隆入表達(dá)載體pBAD構(gòu)建重組質(zhì)粒pBAD-iscA35，pBAD-iscA99，pBAD-iscA101和pBAD-sufA50，pBAD-sufA114，pBAD-sufA116。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入iscA-sufA-雙突變株，構(gòu)建菌株pBAD-IscA35/iscA-sufA-，pBAD-IscA9

8、9/scA-sufA-，pBAD-IscA101/scA-sufA-和pBAD-SufA50/iscA-sufA-，pBAD-SufA114/iscA-sufA-，pBAD-SufA116/iscA-sufA-。L-阿拉伯糖誘導(dǎo)其表達(dá)，用Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定。 4.構(gòu)建菌株生長(zhǎng)狀態(tài)測(cè)定 分別測(cè)定這些構(gòu)建菌株的生長(zhǎng)曲線。 結(jié)果： 1.大腸桿菌iscAsufA雙突變株的構(gòu)建利用打靶載體pK

9、OV-iscA-、pKOV-suyA-獲得iscA-單突變株，sufA-單突變株及iscA-sufA-雙突變株；PCR鑒定經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約1kp的目的條帶。 2.iscA和sufA基因的導(dǎo)入利用表達(dá)載體pBAD將iscA和sufA分別克隆到iscA-sufA-雙突變株，得到菌株pBAD-IscA/iscA-sufA-和pBAD-SufA/iscA-sufA-。PCR鑒定經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約300bp的目的條帶；測(cè)序結(jié)果證

10、實(shí)基因序列正確。 3.iscA和sufA基因的定點(diǎn)突變利用定點(diǎn)突變技術(shù)得到定點(diǎn)突變的菌株pBAD-IscA35/iscA-sufA-，pBAD-IscA99/iscA-sufA-，pBAD-IscA101/iscA-sufA-和pBAD-SufA50/iscA-sufA-，pBAD-SufA114/iscA-sufA-，pBAD-SufA116/iscA-sufA-。PCR鑒定經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見約300bp的目的條帶；經(jīng)L-阿

11、拉伯糖誘導(dǎo)的菌液裂解產(chǎn)物上清通過Tricine-SDS-PAGE電泳在約13kD處可見目的條帶；測(cè)序結(jié)果顯示突變位點(diǎn)正確。 4.構(gòu)建菌株生長(zhǎng)狀態(tài)測(cè)定通過以野生型大腸桿菌MC4100作為對(duì)照測(cè)定生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，iscA-和sufA-的生長(zhǎng)狀態(tài)影響不大，而iscA-sufA-雙突變株在有氧條件下，在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中幾乎不生長(zhǎng)；在厭氧條件下，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中可以恢復(fù)部分生長(zhǎng)。pBAD-IscA/iscA-sufA

12、-和pBAD-SufA/iscA-sufA-可以恢復(fù)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)，而pBAD-IscA35/iscA-sufA-，pBAD-IscA99/iscA-sufA-，pBAD-IscA101/iscA-sufA-和pBAD-SufA50/iscA-sufA-，pBAD-SufA114/iscA-sufA-，pBAD-SufA116/iscA-sufA-不能恢復(fù)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)。 結(jié)論： 利用敲除技術(shù)成功獲得iscA和sufA缺