鐵調(diào)素對骨代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、“鐵蓄積”與“骨代謝”關(guān)系研究比較豐富，很多觀點(diǎn)認(rèn)為“鐵蓄積”是“絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（I型）”的獨(dú)立危險因素之一。
　　“降鐵方法”防治I型骨質(zhì)疏松，已有較多研究，目前希望能在骨質(zhì)疏松防治中增加新的臨床治療方法。
　　在降鐵方式中，常有“鐵螯合劑”和鐵調(diào)素。鐵調(diào)素（hepcidin）是Park于2001年發(fā)現(xiàn)的一種多肽類激素，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一的降鐵激素。
　　利用鐵調(diào)素進(jìn)行的I性骨質(zhì)疏松防治研究開展很少，本研究以鐵調(diào)素為干

2、預(yù)方法，研究“鐵蓄積與骨代謝”的相關(guān)性。
　　本研究主要內(nèi)容：
　　第一部分：利用hepcidin基因敲除小鼠模型，了解：hepcidin基因表達(dá)缺失的情況下，機(jī)體鐵代謝及骨代謝變化，這部分主要考慮目前現(xiàn)有的鐵蓄積動物模型建模方法干擾因素多，組間差異大，而“hepcidin基因敲除小鼠”是穩(wěn)定的、組間差異小的、較好的“鐵蓄積”模型。
　　第二部分：以鐵調(diào)素為干預(yù)手段，了解小鼠原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中加入鐵調(diào)素后的變化，這

3、部分主要考慮成骨細(xì)胞膜上有膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Ferroportin，F(xiàn)PN1）及L型鈣離子通道，允許鐵離子及鈣離子進(jìn)出細(xì)胞，當(dāng)鐵調(diào)素干預(yù)后，成骨細(xì)胞內(nèi)鐵離子和鈣離子濃度發(fā)生變化，這可能是骨代謝發(fā)生變化的一個細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　第三部分：以鐵調(diào)素為干預(yù)手段，了解鐵調(diào)素干預(yù)RAW264.7細(xì)胞后，破骨細(xì)胞分化、增殖、功能的變化，這部分主要考慮破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中的一個重要因素，了解鐵調(diào)素對破骨細(xì)胞的影響可為骨質(zhì)疏松的治療提供一

4、些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　第一部分：鐵調(diào)素基因缺失對小鼠鐵代謝及骨代謝的影響
　　目的:觀察C57BL/6小鼠在hepcidin基因敲除后，鐵代謝與骨代謝變化情況，分析hepcidin基因缺失對小鼠鐵代謝及骨代謝的影響。
　　方法:將7月齡小鼠根據(jù)基因型分為2組：hepcidin基因敲除小鼠（hepc-/-小鼠）與野生型小鼠（hepc+/+小鼠），每組10只，檢測小鼠體重、血清鐵、鐵蛋白、血清Ⅰ型膠原交聯(lián)C-末端肽（cross

5、-linked C-lelopeptide of typeⅠcollagen, CTX）水平、血清骨鈣素水平、肝臟和骨組織鐵濃度、肝臟與骨組織普魯士藍(lán)染色、骨骼遠(yuǎn)端Micro-CT。
　　結(jié)果:兩組小鼠體重及血清CTX水平無明顯差異，hepc-/-小鼠的血清鐵、鐵蛋白、肝臟和骨組織鐵濃度指標(biāo)均顯著高于hepc+/+小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，普魯士藍(lán)染色進(jìn)一步證實(shí)肝臟和骨組織存在嚴(yán)重的鐵沉積；hepc-/-小鼠的血清骨鈣素水平低于he

6、pc+/+小鼠，Micro-CT結(jié)果顯示：hepc-/-小鼠的骨小梁數(shù)量、厚度、密度、骨體積分?jǐn)?shù)、皮質(zhì)骨的厚度、面積均低于hepc+/+小鼠，而皮質(zhì)骨內(nèi)徑高于hepc+/+小鼠。
　　結(jié)論C57BL/6小鼠的hepcidin基因敲除后，可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)嚴(yán)重的鐵蓄積，并導(dǎo)致小鼠骨量下降，這一過程可能與小鼠的骨重建受到抑制有關(guān)。
　　第二部分：鐵調(diào)素對C57BL/6小鼠原代成骨細(xì)胞分化、增殖及功能活性的影響
　　目的:探討鐵

7、調(diào)素對C57BL/6小鼠原代成骨細(xì)胞分化、增殖及活性的影響。
　　方法取出生1天的C57BL/6小鼠，分離得到成骨細(xì)胞，將不同濃度的鐵調(diào)素加入細(xì)胞培養(yǎng)基，用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活性；對細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）染色、Van Gieson染色和Von kossa’s染色。
　　結(jié)果:CCK-8檢測結(jié)果顯示鐵調(diào)素對C57BL/6小鼠原代成骨細(xì)胞的增殖無抑制及促進(jìn)作用（0-800

8、nmol/L），在400nmol/L濃度組，ALP染色面積明顯較對照組高，Van Gieson染色也提示該濃度組陽性面積明顯增大，其他劑量組無明顯差異。各劑量組Von kossa’s染色無明顯差異。
　　結(jié)論:鐵調(diào)素對C57BL/6小鼠的增殖及礦化無顯著影響，但在一定劑量范圍內(nèi)，可促進(jìn)其分泌Ⅰ型膠原及ALP的表達(dá)。
　　第三部分：鐵調(diào)素對小鼠單核細(xì)胞RAW264.7向破骨細(xì)胞分化的影響
　　目的:探討鐵調(diào)素對小鼠單核細(xì)

9、胞株RAW264.7向成熟破骨細(xì)胞分化的影響。
　　方法:將不同濃度鐵調(diào)素加入含有核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand，RANKL）的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基，24 h后用CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活性；4d后對細(xì)胞進(jìn)行抗酒石酸酸性磷酸酶（Tratrate-resistant acid phostase，TRAP）染色，光鏡下觀察；用R

10、T-PCR法檢測TRAP、組織蛋白酶K（CTK）、金屬蛋白酶9（MMM-9）基因表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測上清液中TRAP-5b含量；24h后用共聚焦顯微鏡（CLSM）測定細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度。
　　結(jié)果:鐵調(diào)素在0～800nmol/L濃度圍內(nèi)可增加RAW264.7細(xì)胞TRAP染色陽性數(shù)目，上調(diào)TRAP、CTK和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metall