鐵調(diào)節(jié)蛋白2基因敲除小鼠鐵代謝異常及其對(duì)骨代謝的影響.pdf

1、目的：
　　觀察鐵調(diào)節(jié)蛋白2（Iron Regulatory Protein2，Irp2）基因敲除小鼠體內(nèi)鐵代謝和骨代謝的改變，探討鐵代謝紊亂在老年小鼠骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的作用及其機(jī)制。
　　方法：
　　本課題擬利用15月齡鐵調(diào)節(jié)蛋白2基因敲除C57BL/6雌性小鼠（Irp2-/-，內(nèi)源性鐵過(guò)載模型）為研究對(duì)象，另外選擇6只同月齡健康雌性野生型（Irp2+/+）小鼠作為對(duì)照組。取小鼠第6腰椎行Micro CT并三維重建；

2、對(duì)第6腰椎進(jìn)行骨組織切片，并行普魯士藍(lán)鐵染色及HE染色，觀察骨組織鐵沉積情況和骨組織的結(jié)構(gòu)變化；采用原子吸收光譜法檢測(cè)小鼠第6腰椎骨鐵、骨鈣、骨磷以及小鼠肝鐵含量；Realtime PCR法檢測(cè)骨組織中鐵代謝相關(guān)基因[膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Ferroportin-1, Fpn1）、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（Transferrin receptor-1, Tfr1）、鐵蛋白輕鏈（Ferritin light chain, Ftl）、鐵調(diào)素（Hepcidi

3、n）]，及骨代謝相關(guān)基因[骨組織中堿性磷酸酶（Bone alkaline phosphatase, Balp）、骨鈣素（Bone Gla Protein, Bglap）、Ⅰ型膠原α1鏈（TypeⅠ collagen alpha1 chain, ColⅠα1）、組織蛋白酶K（Cathepsin K, Ctsk）、活化T細(xì)胞核因子（Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic1, Nfatc

4、1）、核因子κB受體活化因子（Receptor activator of nuclear factorκB, Rank）、抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-resistant acid phosphonatase, Trap）]的表達(dá)情況；Western-blot方法檢測(cè)骨組織中鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)水平；比色法檢測(cè)血清鐵，微板法檢測(cè)血清鈣水平，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清中反映成骨細(xì)胞活性（Balp、Bglap、COLⅠα1

5、）和破骨細(xì)胞活性[Ctsk、Trap、Ⅰ型膠原末端片段（C-terminal telopeptide of typeⅠ collagen, CTX-1）]的指標(biāo)，同法檢測(cè)血清25羥維生素D3[25(OH)D3]水平和肝組織內(nèi)維生素D25-羥化酶（CYP2R1）的活性。
　　結(jié)果：
　　1 Micro CT結(jié)果顯示，與野生型小鼠相比，Irp2-/-組小鼠骨密度更低，骨小梁稀疏、數(shù)量更少，骨小梁的連續(xù)性下降、空隙增加，可見(jiàn)多處骨

6、小梁斷裂，骨組織結(jié)構(gòu)破壞明顯。三維重建相關(guān)參數(shù)分析顯示，和野生型小鼠相比，Irp2-/-組小鼠第6腰椎骨密度（BMD）和骨小梁數(shù)量（Tb.N）顯著降低（P分別<0.05和0.01）；
　　2骨組織切片普魯士藍(lán)鐵染色顯示：與Irp2+/+組小鼠相比，Irp2-/-組小鼠骨鐵沉積明顯降低；HE染色示：兩組小鼠均表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松，Irp2-/-組小鼠骨小梁更加稀松、薄弱、易斷裂，骨質(zhì)明顯下降，骨質(zhì)疏松癥更為嚴(yán)重；
　　3原子吸收光譜

7、法結(jié)果示：Irp2-/-組小鼠肝鐵含量明顯高于野生組（P<0.001），骨鐵、骨鈣和骨磷含量顯著低于野生組小鼠（P<0.01或P<0.05）；
　　4鐵代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況：與Irp2+/+組相比，Irp2-/-組小鼠骨組織中Fpn1和Tfr1基因表達(dá)水平明顯下降（P<0.05），F(xiàn)tl、Hepcidin基因表達(dá)水平顯著升高（P均<0.05）；
　　5骨代謝相關(guān)基因的表達(dá)情況：Irp2-/-組小鼠骨組織Balp、Bglap

8、、ColⅠα1等成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平較Irp2+/+組明顯下降（均P<0.05）；Ctsk、Nfatc1、Rank、Trap等破骨相關(guān)基因的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05或P<0.001）；
　　6鐵代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：Irp2-/-組小鼠骨組織中鐵蛋白重鏈（Ferritin heavy chain, FTH）、FTL、FPN1和鐵調(diào)節(jié)蛋白1（Iron Regulatory Protein1, IRP1）表達(dá)水平較野生組小鼠

9、顯著降低，TfR1和二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體（Divalent Metal Transporter1 without iron-responsive elements, DMT1-IRE）蛋白表達(dá)水平較Irp2+/+組小鼠明顯升高（P分別<0.05和0.01）；
　　7與Irp2+/+組小鼠相比，Irp2-/-組小鼠血清鐵水平（64.71±5.21μmol/L vs154.01±65.09μmol/L，P<0.01），以及血清Balp（

10、132.93±4.82μmol/L vs166.66±18.83μmol/L， P<0.01）、Bglap（1.84±0.17μmol/L vs2.86±0.19μmol/L，P<0.001）和COLⅠα1（20.21±0.91 ng/ml vs24.98±2.04 ng/ml， P<0.001）等反映成骨細(xì)胞活性的指標(biāo)顯著降低，血清Ctsk（72.42±1.82μmol/L vs62.73±7.00μmol/L，P<0.05）、Tra

11、p（40.63±2.43 U/L vs36.42±2.77 U/L，P<0.05）和CTX-1（2.74±0.33μmol/L vs2.19±0.42μmol/L，P<0.05）等反映破骨細(xì)胞活性的指標(biāo)明顯升高。與Irp2+/+組小鼠相比，Irp2-/-組小鼠肝臟25-羥化酶（CYP2R1）（1.21±0.18 ng/mg vs1.94±0.14 ng/mg， P<0.001）活性和血清25羥維生素D3[25(OH)D3]（25.63±

12、0.98μmol/L vs28.40±1.66μmol/L，P<0.01）水平顯著降低。兩組間血鈣水平無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論：
　　1 Irp2基因敲除可導(dǎo)致小鼠體內(nèi)鐵代謝紊亂及鐵分布異常（肝鐵沉積嚴(yán)重，骨鐵含量減少），小鼠骨組織內(nèi)鐵代謝相關(guān)基因及其蛋白的表達(dá)也發(fā)生了明顯變化，以代償Irp2-/-小鼠體內(nèi)的鐵代謝紊亂。
　　2兩組小鼠均發(fā)生骨質(zhì)疏松，Irp2-/-小鼠骨質(zhì)疏松程度更加嚴(yán)重。
　　3鐵代謝紊亂可加重