用于快速檢測豬瘟抗體雙功能分子的構(gòu)建及表達.pdf

1、豬瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由豬瘟病毒引起的豬的一種急熱性、致死性疾病。給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。對豬瘟抗體進行定期監(jiān)測對豬瘟的防制具有重要意義，針對目前還沒有一種適合基層單位使用的、簡便、快速、穩(wěn)定的豬瘟抗體檢測方法的現(xiàn)狀，本項目根據(jù)紅細胞凝集試驗的原理開展用于快速檢測豬瘟抗體的雙功能試劑方面的研究。研究主要結(jié)果如下： 1、雙功能分子的拼接及其原核表達載體的構(gòu)建采用重疊延伸拼接(SOE)

2、PCR的方法將2E8ScFv(抗人紅細胞H抗原單鏈抗體基因)和mE2(豬瘟E2基因主要抗原區(qū)基因)拼接成融合雙功能分子，命名為2E8mE2，將融合基因克隆入PMD18-T Simple載體，測序正確后，再亞克隆入PET-DsbA原核表達載體，通過PCR和酶切鑒定，均能獲得大約1125bp的目的條帶。表明原核表達載體PET-DsbA-2E8mE2構(gòu)建成功。 2、2E8mE2重組蛋白的表達將PET-DsbA-2E8mE2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

3、BL21(DE3)PlysS原核表達菌株，用常規(guī)方法進行表達，經(jīng)超聲波裂解，SDS-PAGE電泳分析重組蛋白的性質(zhì)，然后通過不同的溫度、IPTG濃度、誘導(dǎo)時間的梯度來篩選最佳表達條件。結(jié)果表明：2E8mE2重組蛋白獲得了高效表達，占細菌總量的30％；表達產(chǎn)物大部分是以不溶的包涵體形式存在；在37℃，IPTG濃度為0.3mmol/L，誘導(dǎo)時間為3h的條件下重組蛋白可獲得最佳表達。分別用6×His單克隆抗體和CSFV高免血清對表達的重組蛋白

4、進行Western-blot檢測，結(jié)果顯示：重組蛋白與6xHis單克隆抗體及CSFV陽性血清均呈陽性反應(yīng)，呈現(xiàn)清晰的特異性反應(yīng)條帶，而空載體誘導(dǎo)菌的菌體蛋白無上述反應(yīng)條帶。表明所表達的重組蛋白是特異的。 3、2E8mE2重組蛋白包涵體的復(fù)性及檢測超聲波破碎處理重組菌，收集重組蛋白包涵體，用0.5％TritonX-100和1mol/L NaCl洗滌包涵體后用尿素溶解，利用Ni-NTA樹脂對溶解的蛋白進行親和層析純化，然后利用谷胱甘