用于尿微量白蛋白檢測(cè)的抗體微陣列構(gòu)建.pdf

1、目的：充分利用蛋白質(zhì)組學(xué)之新穎技術(shù)——抗體微陣列（也稱抗體芯片）的高靈敏度、高特異性、高通量等優(yōu)勢(shì)，探討基于直接標(biāo)記法的尿微量白蛋白檢測(cè)抗體微陣列的構(gòu)建方法，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，并初步評(píng)價(jià)其技術(shù)可行性和臨床實(shí)用價(jià)值。 方法：通過(guò)玻片處理、活化、固定等程序構(gòu)建白蛋白抗體芯片，摸索用NHS-生物素標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白及尿液樣本的最佳條件，經(jīng)封閉后加入生物素標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白，孵育、洗滌后加入鏈酶親和素-Cy3，再經(jīng)過(guò)孵育、洗滌后用共聚焦激光掃

2、描儀獲取熒光強(qiáng)度值，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度值做出濃度-信號(hào)強(qiáng)度曲線，并評(píng)價(jià)其檢測(cè)靈敏度、特異性、重復(fù)性。收集臨床糖尿病患者尿液標(biāo)本，對(duì)尿液樣本同時(shí)行免疫比濁法和抗體芯片法檢測(cè)白蛋白值，將兩種方法檢測(cè)值行相關(guān)性分析。 結(jié)果：針對(duì)目標(biāo)抗原為白蛋白的生物素標(biāo)記樣本，總蛋白/生物素質(zhì)量比為2：1時(shí)標(biāo)記效果最佳；在其他條件相同情況下比較不同孵育溫度對(duì)樣本標(biāo)記效果的影響，孵育溫度為37℃時(shí)較0℃、4℃和25℃更能獲得理想的檢

3、測(cè)信號(hào)；標(biāo)記后的樣本立即行免疫分析檢測(cè)與存放24小時(shí)和1周后檢測(cè)的信號(hào)無(wú)明顯差異；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白所做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線其R2可達(dá)0．9979；捕獲抗體濃度為1mg/ml時(shí)最低白蛋白檢測(cè)濃度為0．05ug/ml；特異性檢測(cè)提示未標(biāo)記白蛋白與樣本中標(biāo)記白蛋白競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合芯片上固定的捕獲抗體，呈濃度依賴性。陣列內(nèi)變異系數(shù)為3．35％-7．59％，陣列間變異系數(shù)為6．47％-9．84％；抗體芯片檢測(cè)值與免疫比濁法檢測(cè)值顯著相關(guān)（R2=0．9206），且