抗EGFR人源化抗體的構(gòu)建、表達(dá)、純化和功能分析.pdf

1、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)是一種跨膜的酪氨酸激酶受體，由N末端的胞外配體結(jié)合域，疏水性的跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域(錨定受體于細(xì)胞膜上)和胞內(nèi)的酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域三部分組成，是HER受體家族的一員。當(dāng)EGFR與配體結(jié)合后，胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域就會(huì)發(fā)生交聯(lián)磷酸化作用，從而引起下游一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路的活化。EGFR不僅在人體的所有表皮細(xì)胞和一些正常組織細(xì)胞中表達(dá)，且在人體許多實(shí)體瘤中出現(xiàn)過(guò)表

2、達(dá)的現(xiàn)象，受體的表達(dá)水平與腫瘤的分化程度、惡性程度、腫瘤的侵潤(rùn)及預(yù)后密切相關(guān)。所以以EGFR為靶點(diǎn)治療腫瘤已經(jīng)成為腫瘤治療的一個(gè)新的熱點(diǎn)，市場(chǎng)上也出現(xiàn)了以EGFR為靶點(diǎn)的小分子化學(xué)藥物和大分子的單抗藥物，如抗EGFR的人鼠嵌合抗體Cetuximab。
　　 本實(shí)驗(yàn)室以Cetuximab為模板，設(shè)計(jì)合成抗體輕鏈基因序列和重鏈可變區(qū)基因序列，拼接成完整的輕重鏈基因并克隆到pIRES雙表達(dá)載體中，已成功構(gòu)建出7種表達(dá)載體C1～C7，其

3、中的C3(即3?？贵w)與抗原的結(jié)合能力較高。本研究就是在此基礎(chǔ)之上，重新把抗體的4種輕鏈基因和3種重鏈基因分別克隆到載體pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(-)上，得到4種抗體輕鏈基因的表達(dá)載體(命名為PL1、PL2、PL3和PL4)和3種重鏈基因的表達(dá)載體(命名為PH1、PH2和PH3)。共轉(zhuǎn)染輕鏈和重鏈的表達(dá)載體到293T細(xì)胞，重組得到12種抗體。ELISA法檢測(cè)抗體與抗原的結(jié)合能力，結(jié)果顯示7#、10#和11#抗體與抗原的親

4、和力較高。重新將3#、7#、10#和11#抗體的輕重鏈基因片段分別克隆到高表達(dá)的pcDNA3.1載體上，然后共轉(zhuǎn)染到CHO細(xì)胞中，G418抗性篩選穩(wěn)定單細(xì)胞克隆系。Westernblot和ELISA法檢測(cè)抗體的表達(dá)和親和力，結(jié)果顯示除了3#抗體的結(jié)合能力低之外，其它3種抗體與抗原的結(jié)合能力都較好。擴(kuò)大7#、10#和11#抗體的穩(wěn)定細(xì)胞系的培養(yǎng)規(guī)模，收集細(xì)胞上清，用rProteinA親和層析純化濃縮抗體，最終得到110mg的7#抗體、15

5、1mg的10#抗體和190mg的11#抗體。Biacore3000技術(shù)檢測(cè)抗體結(jié)合抗原的能力，7#、10#、11#、陽(yáng)性對(duì)照Cetuximab抗體與抗原EGFR的KD值分別為3.87×10-9M、8.16×10-8M、4.29×10-8M和3.74×10-8M，結(jié)果表明人源化抗體與陽(yáng)性對(duì)照相比，與抗原的結(jié)合能力處在同一水平上甚至要略好。細(xì)胞的劃痕實(shí)驗(yàn)也表示7#、10#、11#對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移是有一定的抑制作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)初步顯示這3