人源抗伊維菌素單鏈抗體的篩選、表達(dá)及結(jié)構(gòu)功能分析.pdf

1、伊維菌素是由阿維鏈霉菌發(fā)酵合成的一種大環(huán)內(nèi)酯類多組分抗生素，被有效用作農(nóng)藥、獸藥及人抗寄生蟲藥物。它能打開谷氨酸控制的Cl-通道，導(dǎo)致膜超極化，使肌肉細(xì)胞喪失收縮能力，從而導(dǎo)致蟲體死亡。長期以來，伊維菌素被認(rèn)為是安全的抗寄生蟲藥物，但是近年的研究結(jié)果表明，它的殘留能降低牧草產(chǎn)量，影響水生群落，對環(huán)境平衡有重大威脅。伊維菌素的廣泛應(yīng)用和潛在危害的并存，使得建立一種簡單高效的伊維菌素殘留檢測方法很有必要。
　　 目前建立的伊維菌素檢

2、測方法主要有中空纖維支撐液膜萃取法和液相色譜質(zhì)譜-質(zhì)譜法。這些方法需要昂貴的儀器及繁瑣的前處理步驟，相比之下，免疫檢測法較為快速、經(jīng)濟(jì)?，F(xiàn)已有關(guān)于伊維菌素單克隆和多克隆抗體的報道，還未見其單鏈抗體的報道。本研究在參照國內(nèi)外相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，以期從人源噬菌體抗體庫中篩選出抗伊維菌素的單鏈抗體，并對其進(jìn)行可溶性表達(dá)、蛋白結(jié)構(gòu)功能分析，為環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中伊維菌素的安全監(jiān)控提供材料，為研究抗原抗體反應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。噬菌體展示技術(shù)是一種制備高親和力

3、抗體的有力工具，抗體庫技術(shù)則為篩選高親和力抗體提供了良好的平臺。展示抗體的基因型與表現(xiàn)型的有效統(tǒng)一，使其不僅在農(nóng)藥殘留檢測及抗體制備等方面具有廣泛應(yīng)用前景，還能有效地應(yīng)用于基因工程改造。
　　 研究目的和意義：應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)，篩選人源抗伊維菌素單鏈抗體，以期應(yīng)用于伊維菌素的安全監(jiān)控。對篩選出的抗體進(jìn)行可溶性表達(dá)、純化后鑒定其免疫活性。對抗體的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行分析，為研究抗原抗體結(jié)合反應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。
　　 研究方法：以

4、伊維菌素-牛血清白蛋白為包被抗原，應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)，從庫容約為108的人源噬菌體抗體庫中篩選出抗伊維菌素單鏈抗體。采用固相消減篩選法，共進(jìn)行4輪“吸附-洗脫-富集”。對結(jié)合活性較強(qiáng)的陽性克隆，制備噬菌體上清，轉(zhuǎn)化E.coli HB2151，以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，表達(dá)的可溶性抗體過鎳親和層析柱純化，建立競爭抑制ELISA檢測方法，進(jìn)行靈敏度測定。應(yīng)用計算機(jī)軟件及生物信息學(xué)站點對抗體的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行分析。
　　 研究結(jié)果：經(jīng)過四輪富

5、集篩選，從人源抗體庫中篩選出7株不同的陽性克隆，hsIVM8展示了最高的親和力。IPTG成功誘導(dǎo)表達(dá)hsIVM8，SDS-PAGE顯示其分子量約為28 kD，伊維菌素對純化抗體的抑制中濃度IC50為4.11μg/mL，線性檢測范圍為0.1-5μg/mL。
　　 研究成果：從人源噬菌體抗體庫中成功篩選到抗伊維菌素的單鏈抗體，有望應(yīng)用于環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品中伊維菌素的安全監(jiān)控。對抗體蛋白進(jìn)行的結(jié)構(gòu)功能分析為研究抗體性質(zhì)及與抗原反應(yīng)機(jī)理提供理