伊維菌素抗獨特型和抗異型抗體的制備及鑒定.pdf

1、伊維菌素屬于大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，由于其具有優(yōu)良的驅(qū)蟲特性而廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖中。雖然伊維菌素的作用劑量較小，但是作為脂溶性藥物，它在動物體內(nèi)的殘效時間較長，因此WHO將其列為高毒化合物，所以伊維菌素藥物在動物組織中殘留不容忽視。
　　 目前較常用的檢測IVM的方法主要有色譜技術(shù)，如：高效液相色譜檢測法(HPLC)、氣相色譜(GS)；免疫學(xué)分析方法，如：酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、膠體金免疫測定法(CGIA)等。但是色譜技術(shù)存在著

2、方法復(fù)雜、耗時長、花費大、技術(shù)要求高等原因而不適合大批量樣品的篩選等問題，而免疫學(xué)檢測方法可以解決這些問題，其中的ELISA法就是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大樣品的快速篩選。
　　 常規(guī)的ELISA方法對IVM檢測主要依賴于競爭ELISA法，盡管非競爭ELISA法相對于競爭法有更高的檢測靈敏度，但是由于IVM分子量太小，阻礙其與兩種抗體同時結(jié)合，所以這類檢測方法不適合半抗原的測定。近年來，為解決這個問題，人們做

3、了很多嘗試，其中抗獨特型和抗異型抗體為非競爭法應(yīng)用于半抗原檢測上提供了支持。
　　 為獲取針對伊維菌素(IVM)的抗獨特型抗體或抗異型抗體，制備針對IVM的兔多克隆抗體和鼠單克隆抗體，經(jīng)純化獲得IVM兔多抗血清純化抗體(PAb1)和鼠單抗腹水純化抗體(MAb1)，將PAb1、MAb1分別加入含10μg/mL IVM的20％甲醇-PBS中，4℃反應(yīng)24h，制備兩種抗原抗體復(fù)合物，做為免疫原，分別免疫BALB/c小鼠，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，以

4、PAb1與IVM反應(yīng)制備的復(fù)合物為免疫原的免疫效果較好。選取適宜小鼠融合，通過對雜交瘤細胞的篩選，獲得3株能穩(wěn)定分泌抗IVM獨特型抗體(Ab2)的細胞株，命名為Ab2-1、Ab2-2、Ab2-3。
　　 研究了Ab2的性質(zhì)，結(jié)果表明，Ab2僅與針對IVM的抗體反應(yīng)，且親和性良好(K=5.04×1010L/mo1)，與其它抗體交叉反應(yīng)率較小，其具有很好的特異性。以IVM-OVA為包被原，MAb1為反應(yīng)抗體，Ab2為競爭抗原，IC5

5、0=33.771μg/mL;以Ab2為包被原，MAb1為反應(yīng)抗體，IVM為競爭抗原，IC50=0.4μg/mL，另外還得出線性良好的Ab2與IVM對應(yīng)關(guān)系曲線y=1.9076X-6.4507，以上都表明了Ab2和IVM有很好的內(nèi)影像關(guān)系，驗證了Ab2屬β獨特型抗體。為建立小分子半抗原檢測的競爭ELISA以Ab2β取代作為標準品的強毒性半抗原(如黃曲霉毒素、河豚毒素、嗎啡等)，以及以抗獨特型抗體建立小分子半抗原雙位點法(非競爭)免疫檢測打