T-2毒素抗獨特型多抗的制備及無毒ELISA定量檢測試劑盒的初步研制.pdf

1、背景：T-2毒素屬于單端孢霉烯族化合物中的A族，是該類化合物中毒性最強、污染水平較高的毒素之一，主要是由三線鐮刀菌，梨孢鐮刀菌，擬枝孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌等霉菌產(chǎn)生。T-2毒素主要污染小麥、玉米、大麥、燕麥和黑麥等谷物及麥芽、啤酒和面包等農(nóng)產(chǎn)品。關(guān)于T-2毒素污染情況的報道，大多集中于對谷物和飼料的調(diào)查。據(jù)文獻報道，T-2毒素在各洲的谷物中廣泛存在。國內(nèi)報道在大骨節(jié)病區(qū)小麥、玉米及非病區(qū)小麥、大米中均有檢出。結(jié)合國外資料，認(rèn)為T-2毒素在

2、全世界不同地區(qū)，對不同谷物均有一定程度的污染。 在動物實驗中，T-2毒素對動物顯示了比較明確的免疫毒性及血液毒性，可抑制DNA、RNA及蛋白質(zhì)合成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，引起白細(xì)胞缺乏等。人類誤食了大量污染該類毒素的谷物后，除表現(xiàn)嘔吐、腹痛、腹瀉等急性癥狀外，可有白細(xì)胞缺乏，壞死性咽峽炎，骨髓發(fā)育不良，食管和胃嚴(yán)重壞死等，病死率高(死亡率高達50％-60％)。二戰(zhàn)期間前西伯利亞阿穆爾地區(qū)，數(shù)千人因進食了被鐮刀菌污染的越冬小麥而發(fā)生食物中

3、毒，在后來的產(chǎn)毒試驗中，發(fā)現(xiàn)了高水平的T-2毒素；我國的安徽、河南兩省在1991年因洪澇災(zāi)害而引起霉變小麥中毒，當(dāng)時在采集的48份樣品中，47份均檢出T-2毒素，平均含量在255.9～671.6ppb之間，最高值可達1064.6ppb。此外，T-2毒素還與我國某些地區(qū)食管癌、克山病和大骨節(jié)病的高發(fā)病率有著密切的關(guān)系。近幾十年，T-2毒素還被作為生物戰(zhàn)劑用于戰(zhàn)爭中。 目前，檢測糧谷類食品和飼料中T-2毒素的方法主要有薄層色譜法(T

4、LC)、液相色譜法(LC)、氣相色譜法(GC)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)等。TLC法用目測半定量，靈敏度不高，也不適用于檢測大量樣品的實際需要，也缺乏選擇性和敏感性，近年來應(yīng)用較少。LC、GC是定量的檢測方法，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但缺點是檢出限較高，而且所用儀器設(shè)備較為昂貴。ELISA法是一種準(zhǔn)確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大樣品的快速篩選，我國1992年申報的國標(biāo)GB/T5009.118-2003規(guī)定

5、的方法為ELISA檢測法。 但是，在ELISA法檢測過程中存在一問題，就是必須接觸大量高濃度的T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，檢測人員長期接觸具有潛在的危險性。除此以外，T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴，檢測成本較高。而一種新型的免疫試劑——抗獨特型抗體，因其在空間構(gòu)象上與T-2毒素抗原存在著所謂“內(nèi)影象”關(guān)系，所以有望作為T-2毒素的替代品用于免疫學(xué)檢測，從而實現(xiàn)T-2毒素的無毒檢測，并降低成本。 目的：通過制備T-2毒素抗獨特型抗體，替代

6、免疫檢測中毒素標(biāo)準(zhǔn)品，從而建立無毒ELISA檢測體系，用于我國糧谷中的T-2毒素的檢測。 方法：1采用雜交瘤技術(shù)建立分泌抗T-2毒素的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，采用小鼠體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法生產(chǎn)單克隆抗體，用酶聯(lián)免疫吸附法進行單克隆抗體特性鑒定。 2采用無花果蛋白酶酶切法大量制備單克隆抗體F(ab')2片段，使用快速蛋白純化儀(FPLC)進行分離純化，用酶聯(lián)免疫吸附法進行F(ab')2片段特性鑒定。 3利用片段

7、或片段聯(lián)接物免疫家兔，制備T-2毒素抗獨特型多克隆抗體，用酶聯(lián)免疫吸附法進行多克隆抗體特性鑒定。 4利用所生產(chǎn)的抗獨特型多克隆抗體制備無毒ELISA定量測定試劑盒，并對其相關(guān)技術(shù)參數(shù)進行初步研究。 結(jié)果：1采用雜交瘤細(xì)胞克隆法建立了一株分泌抗T-2毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株(命名為T4F2)。 2抗體特性經(jīng)鑒定，抗體亞類為IgG1型為主，兼有IgG2a、IgG3；抗體腹水效價為1：3.2×106；分子量為150

8、KD；參考工作濃度為1：1×105；純化后抗體IgG含量為6.5mg/ml，共360mg；抗體與其它結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應(yīng)(交叉反應(yīng)率＜1％)；抗體親和力常數(shù)為1.63×10-9mol/L；對T-2毒素最低檢出濃度為0.5ng/ml；T-2毒素50％抑制濃度29.05ng/ml；線性范圍0.5～160.72ng/ml。 3采用無花果蛋白酶酶切法得到單克隆抗體F(ab')2片段，抗體片段特性經(jīng)鑒定，分子量為105kD；參考工作濃度為

9、1：5×103；抗體F(ab')2片段濃度1.291mg/ml；抗體親和力常數(shù)為8.51×10-10mol/L；對T-2毒素最低檢出濃度為0.5ng/ml；20％T-2毒素抑制濃度3.24ng/ml；50％T-2毒素抑制濃度27.84ng/ml；80％T-2毒素抑制濃度144.54ng/ml；線性范圍0.5-176.38ng/ml。 4用抗體F(ab')2片段免疫家兔得到T-2毒素抗獨特型多抗，抗體特性經(jīng)鑒定，抗體亞類為Ab2β

10、型；分子量為150KD；抗體與其它結(jié)構(gòu)類似物無交叉反應(yīng)；抗體親和力常數(shù)為3.06×10-9mol/l；抗獨特型抗體20％抑制濃度1.12μg/ml；抗獨特型抗體50％抑制濃度2.63μg/ml；抗獨特型抗體80％抑制濃度6.72μg/ml；線性范圍0.79～8.24μg/ml。 5建立抗獨特型抗體與T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品之間對應(yīng)關(guān)系曲線，得到二者之間濃度對數(shù)關(guān)系方程Y=2.0651914X+8.7597689 6制備出T-2毒

11、素的無毒ELISA定量檢測試劑盒，試劑盒技術(shù)參數(shù)如下：抗獨特型抗體替代毒素競爭單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程y=-0.7671085x-2.368525(R2=0.994)，由T-2毒素和抗獨特型抗體濃度轉(zhuǎn)換關(guān)系方程得，對T-2毒素最低檢出限為0.5ng/ml(2.5μg/kg)，線性范圍0.5～178.38ng/ml。50％的抑制濃度為27.16ng/ml。對小麥作4ng/ml，20ng/ml和100ng/ml3個加標(biāo)濃度(20、100

12、、500μg/kg)，平均回收率分別為101.4％、95.2和83.17％；三個水平的變異系數(shù)分別為14.4％，7.9％和7.39％。經(jīng)ELISA測定其三個加標(biāo)水平實驗室間變異系數(shù)分別是11.1％，3.9％和4.3％；實驗室內(nèi)變異系數(shù)分別是12.1～15.0％，7.9～13.1％，7.7～10.0％；4℃保存較為穩(wěn)定，37℃可放置半年以上。 結(jié)論：1用T-2-GIgG免疫BALB/c小鼠，運用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)，建立了穩(wěn)定分泌抗

13、T-2毒素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。 2利用獲得的抗體，采用無花果蛋白酶酶切的方法以及FPLC法，建立了快速制備F(ab')2片斷的方法，并鑒定F(ab')2片斷和單抗具有同樣的免疫反應(yīng)性，同時F(ab')2片斷還具有良好的免疫原性，可作為免疫原，用于抗獨特型抗體的生產(chǎn)。 3利用獲得的抗獨特型抗體，開始研制無毒ELISA檢測試劑盒，建立了檢測T-2毒素的間接ELISA法，目前本方法的最低檢出限為2.5μg/kg，小麥樣品