大容量天然人源Fab抗體庫的構(gòu)建及日本血吸蟲抗獨特型抗體的篩選、鑒定.pdf

1、血吸蟲病是一種嚴重危害人民身體健康的人畜共患寄生蟲病。以往的研究證明，以化療為主的血吸蟲病防治策略難以達到阻斷傳播的目的。因此，疫苗成為血吸蟲病防治一項優(yōu)先發(fā)展的策略。血吸蟲本身有多個發(fā)育期，抗原成分復雜多樣，且日本血吸蟲80﹪的保護性抗原為多糖或糖蛋白性質(zhì)，這些糖類抗原表位在血吸蟲保護性免疫及其調(diào)節(jié)方面起著重要作用，但難以用基因工程方法制備。根據(jù)Jerne的免疫網(wǎng)絡(luò)學說，抗獨特型抗體(anti-id)可通過其可變區(qū)中的獨特型表位模擬抗

2、原，誘導出與抗原相似的免疫應(yīng)答。管曉虹等根據(jù)此學說制備了一株日本血吸蟲單克隆抗獨特型抗體NP30，主動免疫小鼠、山羊，具有較好的抗感染免疫和抗病免疫功效。但由于NP30為鼠源性抗體，作為異種蛋白用于人體可產(chǎn)生人抗小鼠抗體(humananti-mouseantibody，HAMA)，從而限制了它在人體的應(yīng)用。本文應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù)，構(gòu)建大容量天然人源Fab抗體庫，從中富集、篩選全人源日本血吸蟲抗獨特型抗體并進行初步鑒定，為研制可用于人體

3、血吸蟲病免疫預防的抗獨特型抗體疫苗奠定基礎(chǔ)。 材料與方法1.取15位健康成人骨髓經(jīng)分離后的淋巴細胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用一組人特異性引物將VH、VLκ、VLλ基因擴增出來，從質(zhì)粒pComb3XTT和pComb3XSS中將CH1、CLκ和CLλ分別擴增出來。再通過重疊PCR得到Fab基因片斷，然后將Fab片斷電導入pComb3XTT中，加入培養(yǎng)基、抗生素、輔助噬菌體VCSM13過夜后，PEG8000沉淀得到天然人源F

4、ab噬菌體抗體庫。 2.以日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(SEA)及成蟲抗原(SWAP)免疫BALB/c小鼠，使用ProteinGHP純化鼠血清得到IgG，分別以正常鼠血清IgG和免疫鼠血清IgG包板，將建立的抗體庫依次孵育后進行六輪洗脫、富集，從第六輪篩選后得到的細菌集落中隨機挑選80個克隆，用ELISA鑒定，將陽性克隆進行可溶性表達。 研究結(jié)果1.用四對κ鏈基因引物、九對λ鏈基因引物和六對重鏈基因引物擴得Fab基因片斷，經(jīng)

5、過一百次電轉(zhuǎn)化將其導入E.coliXLI-Blue菌中，構(gòu)建了庫容為2×109的全人源Fab噬菌體抗體庫。 2.以純化鼠血清IgG為抗原進行了六輪富集篩選，從全人源Fab噬菌體抗體庫中篩選出抗獨特型噬菌體抗體并進行富集。每一輪篩選后，噬菌體抗體收獲率均有增加，第六輪篩選的噬菌體抗體收獲率較第一輪提高了1.4×104倍。 3.經(jīng)ELISA鑒定出四株(C12、C19、D1、D2)抗獨特型抗體。IPTG誘導表達其中一株(C12

6、)表達可溶性抗體。經(jīng)SDS-PAGE電泳，在相對分子量50KD和25KD處出現(xiàn)兩條較明顯的表達帶，為Fab-Histag融合蛋白。 研究結(jié)論1.成功構(gòu)建了大容量天然人源Fab抗體庫，為今后制備針對各種抗原的全人抗體提供了一個技術(shù)平臺。 2.從上述庫中篩選獲得四株日本血吸蟲抗獨特型抗體，對其中一株(C12)進行了可溶性表達，并經(jīng)SDS-PAGE電泳初步鑒定，為制備可用于人體血吸蟲病免疫預防的抗獨特型抗體疫苗候選分子奠定了基