魚源Fab噬菌體抗體庫的篩選、鑒定及抗SAs抗體的可溶性表達(dá).pdf

1、抗體因其獨(dú)特的重組類型和基因結(jié)構(gòu)形成巨大的多樣性，不僅可以通過結(jié)合抗原來有效保護(hù)機(jī)體，同時(shí)也是生物技術(shù)、臨床診療、藥物檢驗(yàn)檢測等許多科學(xué)研究中的重要工具。噬菌體抗體庫技術(shù)因其能夠高效快速的制備高親和力的特異性抗體，被譽(yù)為功能抗體研究史上的巨大變革。目前，該技術(shù)已在醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)理論研究、藥物制造生產(chǎn)、殘留檢測以及病害防治等方面發(fā)揮了重要的作用。但是，在發(fā)展相對滯后的水產(chǎn)領(lǐng)域，該技術(shù)的應(yīng)用研究還少有報(bào)道?；诎唿c(diǎn)叉尾鲴抗體基因信息已比較清晰，

2、所以，本試驗(yàn)對本室自建的斑點(diǎn)叉尾鲴天然Fab噬菌體抗體庫(趙琳，2009)進(jìn)行篩選、鑒定并對篩得抗體進(jìn)行可溶性表達(dá)。具體工作如下：
　　 1抗體庫篩選：
　　 以偶聯(lián)卵血清蛋白的磺胺甲氧嗪(Sulfamethoxypyrida\ine, SMP)和磺胺甲惡唑(Sulfamethoxazde, SMZ)為固相包被抗原，將包被板處理后，對自建的斑點(diǎn)叉尾鲴天然Fab噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選，經(jīng)過5輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的篩選過程，

3、獲得特異性較強(qiáng)的Fab抗體，并對抗體進(jìn)行鑒定。主要結(jié)果如下：
　　 1)從Fab噬菌體抗體庫中經(jīng)過5輪“吸附一洗脫-擴(kuò)增”的篩選，分別得到抗SMP陽性克隆株9個(gè)，抗SMZ陽性克隆株10個(gè)。經(jīng)ELISA檢測，結(jié)果證明所篩得抗體具有一定特異性。
　　 2)分別經(jīng)SacI+XbaI、SpeI+XhoI雙酶切鑒定后，證實(shí)所得到的片段大小與預(yù)想目的片段大小一致。
　　 2Fab段的可溶性表達(dá)：
　　 挑選噬菌體抗體

4、陽性克隆感染大腸桿菌XL1-Blue，擴(kuò)增提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切構(gòu)建Fab可溶性表達(dá)載體p3MHSA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，收集培養(yǎng)液及菌體裂解液上清。進(jìn)行ELISA、SDS-PAGE和Western blot檢測。結(jié)果如下：
　　 1)ELISA結(jié)果顯示在菌體裂解液上清及培養(yǎng)液中均可檢測到可溶性抗體Fab段的表達(dá)，與理論上是一致的。且該抗體分別與偶聯(lián)蛋白的磺胺甲氧嗪和磺胺甲惡唑可特異性結(jié)合。
　

5、　 2)SDS-PAGE及Western-blot結(jié)果證明，抗SMZ克隆分別有4個(gè)克隆、抗SMP克隆有3個(gè)克隆在48KD處出現(xiàn)明顯條帶，與理論計(jì)算值相符，說明表達(dá)成功。
　　 3)通過對表達(dá)較好的陽性克隆的可變區(qū)進(jìn)行GenBank檢索DNA序列分析，證實(shí)該克隆輕鏈可變區(qū)、重鏈可變區(qū)氨基酸序列與GenBank中斑點(diǎn)叉尾鮰免疫球蛋白輕鏈、重鏈同源性均在80％-90％。通常同一基因家族的同源性在85％以內(nèi)，因此可以斷定我們所獲得的輕