蛋白激酶SRPK2在小鼠睪丸組織的表達(dá)特征及初步功能研究.pdf

1、目的：
　　明確絲氨酸/精氨酸蛋白特異激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase2, srpk2)mRNA及編碼蛋白產(chǎn)物在小鼠睪丸組織不同細(xì)胞中的差異表達(dá)特征；進(jìn)一步運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建srpk2的真核表達(dá)質(zhì)粒并建立srpk2過表達(dá)HEK293T細(xì)胞模型；分析srpk2過表達(dá)對(duì)HEK293T細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響，及其與微管結(jié)構(gòu)的相互關(guān)系，為深入探討該基因在精子發(fā)生中的作用及

2、意義奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.利用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time quantitative PCR)分析小鼠睪丸組織四種細(xì)胞系中srpk2基因mRNA的差異表達(dá)；
　　2.利用蛋白免疫印跡技術(shù)(Western blotting)分析小鼠睪丸組織四種細(xì)胞系中srpk2基因編碼蛋白產(chǎn)物的表達(dá)；
　　3.應(yīng)用免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測SRPK2蛋白在小鼠睪丸組織的細(xì)胞定位；
　　4.通過免疫熒光雙重染色

3、觀察SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在生精細(xì)胞中的定位分布；
　　5.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建srpk2真核表達(dá)重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2；
　　6.采用RT-PCR和Western blotting檢測重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后srpk2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平；
　　7.通過CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測過表達(dá)srpk2后HEK293T

4、細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期變化；
　　8.采用間接免疫熒光雙重染色檢測SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在HEK293T細(xì)胞中的定位分布；
　　9.采用Western blotting檢測srpk2過表達(dá)對(duì)聚合態(tài)和未聚合態(tài)微管蛋白影響。
　　結(jié)果：
　　1.實(shí)時(shí)定量 PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示 srpk2在小鼠精母細(xì)胞(GC2-spd)、小鼠支持細(xì)胞Sertoli(TM4)、小鼠間質(zhì)細(xì)胞

5、Leydig(TM3)中的表達(dá)水平相近，而在小鼠精原細(xì)胞(GC1-spg)中的表達(dá)水平較低；
　　2.免疫組化結(jié)果表明SRPK2蛋白在曲精小管中的所有細(xì)胞均有分布，但在精子發(fā)生后期的長形精子細(xì)胞階段相對(duì)集中，同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞也可見到陽性信號(hào)；
　　3.免疫熒光分析顯示SRPK2蛋白定位在精原細(xì)胞的胞漿，精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞的胞漿和胞核都有分布，發(fā)育后期主要集中在長形精子細(xì)胞核附近，在間質(zhì)細(xì)胞定位于胞漿；
　　4.免疫熒光

6、雙重染色結(jié)果顯示SRPK2蛋白與α-Tubulin蛋白在長形精子細(xì)胞核附近存在明顯的共定位關(guān)系；
　　5. DNA測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒pLV-EGFP(2A)Puro-srpk2構(gòu)建成功；
　　6.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，經(jīng)RT-PCR和Western blotting檢測表明srpk2基因在HEK293T內(nèi)實(shí)現(xiàn)了過表達(dá)；
　　7. CCK-8檢測結(jié)果顯示過表達(dá)srpk2組HEK293T細(xì)胞的增殖率明顯高于空

7、載體組及裸細(xì)胞組(P<0.05)，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)過表達(dá)組HEK293T細(xì)胞的G1期明顯降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　8.細(xì)胞免疫熒光雙重染色分析顯示在HEK293T細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的SRPK2蛋白與α-Tubulin蛋白存在共定位關(guān)系；
　　9. Western blotting結(jié)果表明srpk2過表達(dá)可增加聚合態(tài)微管蛋白含量，而減少未聚合態(tài)微管蛋白含量。
　　結(jié)論：
　　1. srpk2在小鼠