SLP-2蛋白在惡性腫瘤組織中的表達意義及功能初步研究.pdf

1、第一部分目的：研究SLP-2基因及蛋白在多種惡性腫瘤組織中的表達，及與腫瘤的臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，初步探討了SLP-2在食管上皮細胞惡變過程中的表達及意義。 方法：應(yīng)用RT-PCR、Western blot 和免疫組織化學染色方法分別檢測220例食管鱗狀細胞癌、104例喉鱗狀細胞癌和263例乳腺浸潤性癌組織和配對正常組織中SLP-2的mRNA和蛋白的表達水平，分析SLP-2蛋白的表達與臨床病理變量之間的相關(guān)性，同時對該蛋白在食

2、管上皮逐級惡性演變過程中的表達進行染色分析。 結(jié)果： 1．SLP-2的基因和蛋白表達水平在食管鱗狀細胞癌組織中較正常食管上皮組織均有明顯升高，上調(diào)發(fā)生率分別為74％和72％，組織芯片的染色結(jié)果驗證了上述結(jié)論，還發(fā)現(xiàn)SLP-2蛋白的高表達與食管鱗狀細胞癌的侵犯程度相關(guān)(P=0.033)； 2．喉鱗狀細胞癌組織中SLP-2的基因表達和蛋白表達均明顯升高，上調(diào)率分別為83％和70％，組織芯片的染色分析發(fā)現(xiàn)，SLP-2蛋

3、白高表達與喉癌患者的進展性臨床分期(P<0.001)和淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移(P=0.003)密切相關(guān)； 3．乳腺癌組織芯片研究顯示，52.5％的乳腺浸潤性癌組織中SLP-2蛋白呈現(xiàn)高表達，且該蛋白的高表達與乳腺腫物的大小(P=0.020)，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移(P<0.001)，進展性臨床分期Ⅲ期(P<0.001)以及發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移(P=0.002)密切相關(guān)。此外，還與HER2/neu蛋白表達存在顯著相關(guān)性(P=0.037)，而與ER/PR的

4、表達無關(guān)。生存分析表明，SLP-2蛋白高表達可以顯著降低乳腺癌患者的總生存率； 4．免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，SLP-2蛋白在食管上皮早期不典型增生階段即有表達上調(diào)，直至食管上皮發(fā)生癌變，但表達量沒有明顯改變，在上皮不典型增生階段，該蛋白主要定位于基底膜處，而在一些浸潤性癌巢中，則主要沉積在癌巢周邊，同時SLP-2蛋白也能敏感的表達于單個侵出的癌細胞。 結(jié)論： 1．SLP-2是一個新的腫瘤相關(guān)基因，在多種腫瘤的發(fā)生過程中

5、發(fā)揮重要作用； 2．SLP-2蛋白的高表達與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)； 3．SLP-2蛋白在腫瘤惡性演變的早期就有一定的表達，提示其可作為腫瘤早期篩查、診斷的有價值的候選分子標志物。 第二部分目的：研究SLP-2蛋白從細胞水平到分子水平的細胞內(nèi)定位，初步明確其功能類型，同時研究可能與其發(fā)生相互作用的蛋白分子。 方法：應(yīng)用超速離心方法分離得到細胞膜的特殊組份一脂筏結(jié)構(gòu)，用Western blot方法

6、檢測該結(jié)構(gòu)組份中是否含有SLP-2 蛋白，經(jīng)免疫電鏡染色，從超微觀察SLP-2蛋白在細胞內(nèi)的亞細胞定位，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)間接免疫熒光染色后的SLP-2蛋白和細胞骨架蛋白a-actin或者β-tubulin之間是否存在共定位關(guān)系，經(jīng)免疫共沉淀實驗和GST pull down實驗分別從細胞內(nèi)、細胞外兩方面研究SLP-2蛋白與細胞骨架蛋白α-actin之間是否存在相互作用。 結(jié)果： 1．經(jīng)脂筏組份的特異性標記物cav

7、eolin-1檢測，確定經(jīng)超速離心后可分離得到脂筏結(jié)構(gòu)，又經(jīng)SLP-2抗體檢測發(fā)現(xiàn)，SLP-2蛋白可在脂筏結(jié)構(gòu)中定位存在； 2．免疫電鏡觀察到，經(jīng)膠體金顆粒標記的SLP-2蛋白主要分布于細胞膜，核膜及細胞漿內(nèi)，而位于細胞漿內(nèi)的金顆粒則主要集中在細胞骨架纖維上，能與骨架纖維穩(wěn)定而特異性的結(jié)合； 3．間接免疫熒光染色結(jié)果顯示，在細胞處于不同運動狀態(tài)下，SLP-2蛋白均僅可與細胞骨架蛋白α-actin之間發(fā)生共定位；

8、4．通過免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，SLP-2蛋白可與骨架蛋白α-actin發(fā)生相互作用，而GST pulldown實驗卻沒有得到相似的結(jié)論。 結(jié)論： 1．SLP-2作為具有生物學活性的分子，可以定位于細胞脂筏結(jié)構(gòu)中，可能參與了細胞膜區(qū)域的信號轉(zhuǎn)導； 2．SLP-2蛋白可以特異性的結(jié)合在細胞漿中的骨架蛋白纖維上，可能作為骨架蛋白或骨架結(jié)合蛋白參與細胞活動的調(diào)節(jié)； 3．實驗結(jié)果表明SLP-2蛋白可以與細胞骨架蛋白α

9、-actin發(fā)生共定位，可以相互作用調(diào)節(jié)細胞的運動過程； 4．實驗結(jié)果初步表明SLP-2蛋白可與骨架蛋白α-actin發(fā)生相互作用，通過與后者的相互作用，來調(diào)節(jié)細胞的運動功能，促進腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，但還需要進一步進行驗證實驗，來最終確認結(jié)果。 第三部目的：進一步驗證細胞骨架相關(guān)的SLP-2 蛋白的功能，特異性抑制其表達是否可以改變細胞侵襲/移動能力，該蛋白表達是否受到誘癌劑TPA的作用，同時結(jié)合生物信息學分析，初步探

10、討該蛋白可能參與的信號通路。 方法：運用RNAi方法特異性地抑制SLP-2基因及其蛋白的表達，從體外細胞侵襲/遷移實驗檢測SLP-2蛋白被特異性抑制后，細胞的侵襲和遷移能力的變化情況，用TPA刺激實驗檢測，SLP-2蛋白的表達變化情況，應(yīng)用生物信息學分析方法，推測SLP-2蛋白可能參與的信號轉(zhuǎn)導通路。 結(jié)果： 1．通過轉(zhuǎn)染化學合成的Hs-STOML2-2小RNA序列，轉(zhuǎn)染后72h為蛋白敲除有效時間點，此時SLP-

11、2蛋白合成幾乎完全被抑制； 2．將轉(zhuǎn)染了特異性的SLP-2-siRNA的細胞進行transwell實驗，發(fā)現(xiàn)SLP-2蛋白表達顯著降低后，腫瘤細胞的體外侵襲能力明顯減弱，但細胞的遷移能力沒有明顯改變； 3．用促癌劑TPA處理的腫瘤細胞，經(jīng)細胞免疫化學染色發(fā)現(xiàn)，EC9706細胞中SLP-2蛋白表達沒有明顯改變，而Hela細胞和KYSE510細胞中SLP-2蛋白的表達均有一定升高； 4．生物信息學分析發(fā)現(xiàn)SLP一2蛋

12、白具有的結(jié)構(gòu)域和Rho家族蛋白的結(jié)構(gòu)域之間可能存在著相互作用。 結(jié)論： 1．通過siRNA的干擾作用，可以有效地敲除目的蛋白的表達； 2．SLP一2蛋白只能影響細胞的侵襲能力對于細胞遷移能力的改變沒有明顯作用； 3．TPA的誘導對于sLP．2蛋白的表達可能存在著細胞差異性，作用時間和變化強度都有所不同； 4．生物信息學分析提示，SLP-2有可能通過與Rho家族蛋白的相互作用，參與Rho信號傳導通路