與睪丸高表達蛋白質(zhì)RNF138相互作用的蛋白激酶NLK的功能研究和睪丸特異表達蛋白質(zhì)RSA-14-44的功能研究.pdf

1、1.絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶NLK的功能研究
　　 本組前期在精子發(fā)生的分子機制研究中分離了一種睪丸高表達蛋白質(zhì)為RNF138[1],后經(jīng)研究提示它可與一種進化上保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶NLK(Nemo-like kinase,NLK)結(jié)合[2]。Zeng等人的研究指出,果蠅的Nemo蛋白能夠磷酸化BMP信號的效應(yīng)分子MAD并促進其出核,從而拮抗BMP信號通路[3]。最近的研究顯示,Smad4能夠結(jié)合NLK并被其磷酸化[4]。

2、這些結(jié)果提示,NLK可能參與TGF-β信號通路調(diào)節(jié),TGF-β信號能夠調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移、凋亡等一系列細胞反應(yīng)；而該信號的異常調(diào)節(jié)則可能導致各種疾病的發(fā)生,如纖維化、惡性腫瘤、自身免疫疾病和心血管疾病等。因此進一步明確NLK在TGF-β信號通路中的功能,將有助于進一步揭示TGF-β信號通路的調(diào)節(jié)機制,從而深化對TGF-β信號失調(diào)和相關(guān)疾病發(fā)生過程的認識。
　　 鑒于揭示NLK在TGF-β信號通路中的調(diào)節(jié)作用已成為當前研究的

3、熱點,本文也由此作了深入的探討。我們首先利用免疫共沉淀實驗,發(fā)現(xiàn)NLK與Smad3之間存在相互作用,并且兩者的結(jié)合依賴于Smad3的MH2結(jié)構(gòu)域。免疫熒光實驗顯示,在TGF-β刺激條件下NLK與Smad3在U2OS細胞中共定位。
　　 在此基礎(chǔ)上,通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析NLK對Smad3介導的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的影響,我們發(fā)現(xiàn),在不同的細胞模型中,瞬時表達NLK均可以抑制Smad3介導的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。同時,我們利用RNA干擾技術(shù),降低

4、HaCaT、HeLa、HepG2和HCT-116細胞中內(nèi)源性NLK的表達,檢測Smad3及其下游靶基因PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)、CTGF(connective tissue growth factor,CTGF)、FN(fibronectin,FN)、p21、p15的變化。結(jié)果顯示,降低細胞內(nèi)NLK的表達水平,磷酸化Smad3以及Smad3總的蛋白質(zhì)水平均顯著上調(diào),而S

5、mad3下游靶基因的蛋白水平也有不同程度的升高。
　　 在此基礎(chǔ)上,我們制備了NLK基因敲除的HCT-116細胞株,即NLK+/-和NLK-/-。首先檢測NLK基因敲除的HCT-116細胞中細胞凋亡的變化,結(jié)果顯示該類細胞并未發(fā)生顯著的凋亡。隨后,利用NLK基因敲除的HCT-116細胞,通過CCK-8法、平板克隆形成實驗和軟瓊脂實驗觀察NLK基因缺失對HCT-116細胞增殖的影響。結(jié)果顯示,NLK基因缺失抑制細胞增殖過程。

6、>　　 2.睪丸特異表達GTPase RSA-14-44蛋白的功能研究
　　 哺乳動物的精子發(fā)生是一個典型的發(fā)育過程,其中涉及生精干細胞遺傳信息的編譯、重組、分配以及生精細胞形態(tài)的顯著變化。精子發(fā)生過程的一個突出特征是具有階段特異性,即在特定的發(fā)育階段,出現(xiàn)特異的細胞或組織結(jié)構(gòu),以執(zhí)行相應(yīng)的特殊功能,而這些特異性結(jié)構(gòu)絕大部分都是精子發(fā)生過程中階段特異性基因表達的結(jié)果。因此,尋找并研究精子發(fā)生過程中差異表達的基因有助于我們深刻理

7、解精子發(fā)生的獨特機制。
　　 在前期工作中,我們鑒定了一個睪丸特異表達的Rho GTPase,并將其命名為RSA-14-44。進一步的實驗證實RSA-14-44與20S蛋白酶體的催化亞基PSMB5之間存在相互作用,并且兩者的結(jié)合依賴于RSA-14-44 C末端190位的半胱氨酸。此外,RSA-14-44主要與PSMB5的前體相互作用,對細胞蛋白酶體活性水平的影響甚微。
　　 本研究主要集中于兩個問題,(1)RSA-14-

8、44與PSMB5亞細胞定位與其相互作用的具體關(guān)聯(lián),(2)RSA-14-44對PSMB5前體加工過程的影響。
　　 我們在MCF-7細胞瞬時表達Flag-RSA-14.44和Myc-PSMB5,觀察兩者在細胞中的定位情況。結(jié)果顯示,RSA-14-44分布于細胞漿,并集中分布于細胞核周；而PSMB5在胞漿胞核均有分布,兩者部分共定位于細胞核周。值得注意的是,將RSA-14-44190位的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸后,其定位從細胞核周擴展至

9、細胞核內(nèi)；蛋白質(zhì)組分分離及分析的結(jié)果也證實了這一結(jié)果。因此,RSA-14-44第190位半胱氨酸的突變會導致其錯誤的亞細胞定位進而影響RSA-14-44與PSMB5之間的結(jié)合。
　　 我們在HEK293T細胞中共表達PSMB5和不同劑量的RSA—14-44。結(jié)果顯示,伴隨著RSA-14-44表達水平的提高,PSMB5前體的蛋白質(zhì)水平顯著下降,而PSMB5前體加工后所產(chǎn)生的PSMB5的蛋白質(zhì)水平基本保持穩(wěn)定。在此基礎(chǔ)上,我們利用C

10、HX(cycloheximide)阻斷蛋白質(zhì)合成,觀察RSA—14-44表達上調(diào)對PSMB5前體的穩(wěn)定性的影響。
　　 結(jié)果表明,RSA-14-44表達水平的上升可以顯著降低PSMB5前體蛋白的穩(wěn)定性,而加工成熟的PSMB5的穩(wěn)定性不受影響:當190位半胱氨酸發(fā)生突變后,RSA-14-44對PSMB5前體蛋白穩(wěn)定性的影響被消除,表明RSA—14-44通過結(jié)合PSMB5,參與負調(diào)節(jié)PSMB5前體蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,進而調(diào)節(jié)蛋白酶體的合