不同1p雜合性缺失特征少枝膠質(zhì)瘤的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腫瘤,發(fā)病率高,但治愈率低。盡管外科新技術(shù)的發(fā)展以及化療、放療的廣泛應(yīng)用使得膠質(zhì)瘤的預(yù)后有所改善,但是大多數(shù)膠質(zhì)瘤的預(yù)后仍然較差。少枝膠質(zhì)瘤(Oligodendroglioma,OG)是膠質(zhì)瘤的主要類型之一,占膠質(zhì)瘤的4-15％,占所有原發(fā)腦腫瘤的2-5％,由于近年來發(fā)現(xiàn)其對化療較為敏感、預(yù)后較好而成為膠質(zhì)瘤研究的熱點。近期研究發(fā)現(xiàn)這些對化療敏感的少枝膠質(zhì)瘤大都有1p/19q的雜合性缺失(Loss of hetero

2、zygosity,LOH)。進一步的研究顯示具有不同1p/19qLOH(或1pLOH)特征的這兩類腫瘤在很多方面還有差異,如好發(fā)部位、腫瘤對放療的敏感性及最終的預(yù)后等等。這些都說明在光鏡下無法區(qū)分的這兩種腫瘤可能是兩類分子生物學(xué)特征不同的腫瘤,對它們的分型可能有助于臨床的治療和預(yù)后的判斷。但是目前除了1p/19q染色體的差異以外,人們對這兩類腫瘤的其它差異如基因表達、蛋白差異乃至最終的分子生物學(xué)機制仍然知之不多,所以有必要對此進一步的研

3、究。
　　蛋白質(zhì)組學(xué)分析是一個能同時研究大量蛋白質(zhì)及其表達變化的方法,正逐漸應(yīng)用于從基礎(chǔ)科學(xué)到臨床實踐科學(xué)的廣泛領(lǐng)域中,受到前所未有的重視。在人類基因組計劃的推動下,人們從基因水平對腫瘤進行了廣泛的研究,并且發(fā)現(xiàn)了許多與腫瘤相關(guān)的基因,包括一些與腫瘤治病有關(guān)的致癌基因和抑癌基因,但基因的功能活動最終要靠蛋白質(zhì)來體現(xiàn)。眾所周知,從DNA-mRNA-蛋白質(zhì)的過程中存在著轉(zhuǎn)錄后剪切和翻譯后的修飾加工,以及蛋白質(zhì)合成后的轉(zhuǎn)移定位等多種變化

4、,所以DNA和mRNA的水平和狀況并不完全代表蛋白質(zhì)的水平和狀況。而以往的蛋白質(zhì)研究方法如Western blot等一次只能對一個或幾個蛋白質(zhì)的表達進行研究。但我們現(xiàn)在知道腫瘤的分子生物學(xué)機制都是涉及成百上千個蛋白活動的過程,因此,有必要從蛋白質(zhì)整體水平來研究、尋找出與腫瘤相關(guān)的特征蛋白質(zhì),闡明其機制。同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAO)技術(shù)是近年來新開發(fā)的一種蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究技術(shù),具有較好的定量效果、較高的重復(fù)性,并可對多達8種不

5、同樣本同時進行定量分析。因此,ITRAQ標(biāo)記一串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)是尋找疾病和腫瘤發(fā)生過程中的標(biāo)志性蛋白或者稱為Biomarker的理想方法。我們此次使用iTRAQ技術(shù)結(jié)合多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D-LCMS/MS)對不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤組織進行比較蛋白質(zhì)組分析,尋找特異蛋白作為診斷標(biāo)志并進一步探求不同少枝膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制。
　　第一部分熒光原位雜交技術(shù)檢測少枝膠質(zhì)瘤1p染色體的雜合性缺失
　　目的:研究少枝膠質(zhì)瘤中1

6、p染色體的雜合性缺失。
　　方法:使用熒光原位雜交技術(shù)對16例少枝膠質(zhì)瘤標(biāo)本及5例正常對照腦組織行1p染色體檢測。
　　結(jié)果:在16例少枝膠質(zhì)瘤中有10例有1p染色體的雜合性缺失,占62.5％,其中6例Ⅱ級腫瘤中有5例缺失,10例Ⅲ級腫瘤中有5例缺失。
　　結(jié)論:1p染色體雜合性缺失是少枝膠質(zhì)瘤的重要分子生物學(xué)特征,通過熒光原位雜交技術(shù),我們可以對這兩類少枝膠質(zhì)瘤有效地加以區(qū)分,并用于進一步的臨床診斷和治療。
　

7、　第二部分基于iTRAQ技術(shù)的少枝膠質(zhì)瘤差異蛋白質(zhì)組分析
　　目的:對不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤進行差異蛋白質(zhì)組分析,尋找特異蛋白用于診斷和治療。
　　方法:使用同位素標(biāo)記相對和絕對定量(iTRAQ)技術(shù)結(jié)合多維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(2D-LCMS/MS)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法對8例不同1pLOH特征的兩組少枝膠質(zhì)瘤進行分析,并用DAVID、KEGG軟件對數(shù)據(jù)進一步處理行生物信息學(xué)分析,通過統(tǒng)計分析找出差異蛋白質(zhì)。
　　

8、結(jié)果:通過蛋白質(zhì)組分析在8例少枝膠質(zhì)瘤中共鑒定得到449個蛋白質(zhì),統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)HMGB1、MAP2、TMSB4X、LRPAP1、MARCKSL1、RPLP2、CISD1、ATP6V1E1、PSAP、PPIF、ARPC5L這11個蛋白在1pLOH的OG中表達較1p正常組腫瘤高,UBA1、PRKAR1A兩個蛋白在1p正常的OG中表達較1pLOH組腫瘤高。
　　結(jié)論:在兩組不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤中找到多個有差異表達的蛋白質(zhì),較其

9、它蛋白質(zhì)組學(xué)方法找到的蛋白譜范圍更廣;生物信息學(xué)分析顯示Actin cytoskeleton通路的不同可能與這兩類腫瘤的不同機制有關(guān),HMGB1、UBA1可能與OG的化療敏感性有關(guān),MAP2可能與OG的預(yù)后有關(guān),ATP6V1E1可能與代謝酶的失調(diào)有關(guān)。
　　第三部分HMGB1、MAP2、UBA1、ATP6V1E1蛋白在不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤中的表達及其意義
　　目的:驗證HMGB1、MAP2、UBA1、ATP6V1E

10、1等差異蛋白在不同1pLOH特征的少枝膠質(zhì)瘤中的表達并分析其意義。
　　方法:使用Western blot對兩組腫瘤中的差異蛋白質(zhì)UBA1、ATP6V1E1進行驗證;并用免疫組化方法對UBA1、ATP6V1E1、MAP2、HMGBl在39例擴大樣本中的表達進行驗證。
　　結(jié)果:Western blot結(jié)果顯示UBA1在1p正常組OG中的表達量高于在1pLOH組中的表達量,ATP6V1E1在1pLOH組OG中的表達量高于1p正