散發(fā)性腎母細(xì)胞瘤DNMT1基于多態(tài)性及1p、19q雜合性缺失的相關(guān)研究.pdf

1、研究目的：
　　HE(hematoxylin-eosin，蘇木素-伊紅)組織化學(xué)染色分析病例組WT(Wilms’tumor，腎母細(xì)胞瘤)腫瘤發(fā)生及演變過(guò)程中的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)；研究分析兒童WT及正常腎組織DNMT1(DNA(cytosine-5-)-methyltransferase1，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1)基因rs16999593、rs75616428位點(diǎn)基因及基因型多態(tài)性；免疫組織化學(xué)分析腫瘤不同組織分型DNMT1(1a.a-148

2、a.a)、DMAP2(DNMT1associatedprotein1，DNMT1相關(guān)蛋白1)及DNMT3a(DNA(cytosine-5)-methyltransferase3A，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3A)蛋白著色情況。研究臨床Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅱ期腫瘤組織1p、16q染色體微衛(wèi)星灶位點(diǎn)D1S1469、D1S1676、D16S3050、D16S303的LOH(lossofheterozygosity，雜合性缺失)情況。
　　研究方法：

3、r>　　1、腫瘤及正常腎臟組織HE組織化學(xué)染色
　　2、腫瘤及正常腎臟組織基因組DNA提取及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
　　3、腫瘤及正常腎臟組織基因組DNA目的基因DNMT1(NT011295.1110291060-10291262)區(qū)段；1p、16q微衛(wèi)星灶位點(diǎn)D1S1469、D1S1676、D16S3050及D16S303擴(kuò)增及純化。
　　4、腫瘤及正常腎臟組織目的片段限制性內(nèi)切酶法及基因測(cè)序法檢測(cè)rs16999593

4、(NT011295.1110291181)、rs75616428(NT011295.1110291113)基因型檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)分析用SHEsis軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡、基因型頻率、等位基因頻率、連鎖不平衡及單倍體分析，連鎖不平衡檢測(cè)采用D’值和r2值來(lái)分析。
　　5、免疫組織化學(xué)檢測(cè)DNMT1(1a.a-148a.a)、DMAP1、DNMT3a在腫瘤組織胚芽、上皮及間質(zhì)組織，正常腎臟組織血管、腎小球及腎小管的著色

5、情況，方差分析法統(tǒng)計(jì)腫瘤組織及正常腎臟組織中各蛋白強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)差異。
　　6、聚丙烯酰胺凝膠電泳-銀染法檢測(cè)1p、16q微衛(wèi)星灶位點(diǎn)LOH情況，方差分析統(tǒng)計(jì)法分析臨床Ⅲ-Ⅴ、Ⅰ-Ⅱ期腫瘤組織1p、16q染色體微衛(wèi)星灶位點(diǎn)的LOH差異情況。
　　結(jié)果：
　　1、WT起源于后腎胚胎組織，HE組織化學(xué)染色顯示腫瘤組織包含胚芽、上皮及間質(zhì)多種組織形態(tài)，且以胚芽組織為主型腫瘤組織內(nèi)血管成分缺無(wú)，而上皮為主型腫瘤組織內(nèi)可見(jiàn)少量血管分

6、布，總體上腫瘤組織內(nèi)血管分布少于正常腎臟組織。
　　2、SHEsis軟件分析顯示，與正常腎臟組織相比，WT組織rs16999593C/T、T/T基因頻率及基因型頻率明顯高于正常腎臟組織(P<0.05)；兩位點(diǎn)連鎖，但rs75616428的G基因頻率偏低。
　　3、免疫組織化學(xué)顯示DNMT1、DMAP1、DNMT3a蛋白主要以細(xì)胞核著色為主，從組織結(jié)構(gòu)分析，三種蛋白在正常腎臟組織內(nèi)的腎小球部分細(xì)胞(60％左右)、腎小管(90％

7、以上)內(nèi)皮細(xì)胞胞核都有著色，而血管內(nèi)皮細(xì)胞著色甚少(35％左右)；腫瘤組織內(nèi)胚芽、上皮及間質(zhì)成分均有著色(80％以上)。但總體上三種蛋白在腫瘤及正常腎臟組織著色不存在差異。
　　4、微衛(wèi)星灶位點(diǎn)LOH檢測(cè)顯示腫瘤組織D16S303位點(diǎn)存在LOH(51.4％)，且與Ⅰ-Ⅱ期患者相比，Ⅲ-Ⅴ期發(fā)生LOH人數(shù)明顯高于前者(P<0.1)。
　　結(jié)論：
　　WT是一種起源于后腎胚胎組織且包含多種組織成分的胚胎性腫瘤；盡管DNMT