FGFR1在胃癌中的作用及靶向FGFR1抑制劑抗胃癌的活性和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1、探討FGFR1在胃癌中的表達(dá)情況及在胃癌中的作用;
　　2、探索靶向FGFR1抑制劑L6123和AZD4547的抗胃癌活性及機(jī)制。
　　方法：
　　(1)提取胃癌手術(shù)后切除下來的胃癌及癌旁正常組織中RNA和蛋白，用RT-PCR和Western Blotting方法分別檢測組織標(biāo)本中FGFR1mRNA以及FGFR1蛋白的表達(dá)情況;(2)提取胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803，小

2、鼠胚胎成纖維細(xì)胞Balb/c3T3及人正常胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1的蛋白，用WesternBlotting檢測FGFR1蛋白的表達(dá)情況;用MTT方法探索上述幾種細(xì)胞對FGF2敏感性;用siRNA技術(shù)探索FGFR1在胃癌細(xì)胞增殖中起到的作用;用MTT方法檢測FGFR抑制劑AZD4547的體外抗胃癌活性;(3)研究體內(nèi)動物模型中FGFR抑制劑AZD4547抗胃癌活性，選用Nu/nu BALB/c裸鼠建立SGC-7901異位移植瘤的裸小鼠腫瘤

3、模型，以劑量為20mg/kg/day的AZD4547給藥，計算相對腫瘤體積、瘤重率，用Western Blotting檢測FGFR信號通路的抑制情況以及免疫組化的方法研究FGFR抑制劑AZD4547的體內(nèi)抗胃癌增殖活性;(4)用MTT探索新型非ATP競爭性靶向FGFR1抑制劑L6123抗胃癌細(xì)胞增殖的效果以及L6123的靶向選擇性;(5)用Western Blotting進(jìn)行探索細(xì)胞層面上L6123抗胃癌的機(jī)制;(6)用Western

4、Blotting、Hoechst33258染色法和流式細(xì)胞技術(shù)探索L6123對胃癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制;(7)用Transwell小室進(jìn)行探索L6123對胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　結(jié)果：
　　(1)與癌旁組織相比，胃癌組織中相對FGFR1mRNA表達(dá)明顯升高(P=0.0425＜0.05)，高表達(dá)率為54.21％（高出一倍以上的，定義為高表達(dá)）;除在mRNA層面上檢測外，還隨機(jī)抽取12對組織標(biāo)本，進(jìn)行FGFR1蛋白層面表

5、達(dá)情況的檢測，發(fā)現(xiàn)在胃癌組織標(biāo)本中FGFR1在mRNA和蛋白層面都存在高表達(dá)。
　　(2)與正常人胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1相比，胃癌細(xì)胞SGC-7901、BGC-823、MGC-803的FGFR1蛋白是高表達(dá)的，并且高表達(dá)FGFR1的細(xì)胞對FGF2的刺激更加敏感;胃癌細(xì)胞增殖生長曲線提示，用siRNA技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞中FGFR1的表達(dá)后，相比較于空白組和轉(zhuǎn)染NC組，轉(zhuǎn)染siRNA-FGFR1組細(xì)胞增殖明顯受抑制;此外，F(xiàn)GFR抑制

6、劑AZD4547在三株胃癌細(xì)胞中均表現(xiàn)出良好的抗胃癌增殖活性。
　　(3)體內(nèi)抗胃癌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)GFR抑制劑AZD4547不但能抑制胃癌腫瘤組織生長，抑瘤率為68.36％，還能有效的抑制FGFR1信號通路相關(guān)蛋白以及增殖指標(biāo)Ki67的表達(dá);
　　(4)與NDGA相比，L6123在三種胃癌細(xì)胞（SGC-7901、BGC-823和MGC-803）中均表現(xiàn)出良好的抗增殖作用;且對小鼠胚胎成纖維野生型細(xì)胞MEF-WT的抗增殖

7、活性要強(qiáng)于小鼠胚胎成纖維FGFR1/FGFR2/FRS2α敲除型細(xì)胞MEF-FGFR1-FGFR2-FRS2α-KO;觀察對這兩種細(xì)胞IC50值的差異，可以發(fā)現(xiàn)L6123的靶向選擇性要優(yōu)于NDGA; FGFR1的敲除可以抑制L6123的抗增殖活性;
　　(5)L6123在抑制胃癌細(xì)胞增殖的同時可以有效抑制FGFR1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá);L6123通過上調(diào)促凋亡蛋白Cleaved-caspase3、pro-caspase-3和BC

8、L-2，同時下調(diào)抗凋亡蛋白cleaved-PARP的表達(dá)來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡;L6123除可以誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡外，還可以抑制胃癌細(xì)胞的侵襲。
　　結(jié)論：
　　(1)FGFR1在部分人胃癌組織和胃癌細(xì)胞株中是高表達(dá)的，對于FGFR1高表達(dá)的胃癌，沉默F(xiàn)GFR1表達(dá)可有效抑制胃癌細(xì)胞增殖，因此FGFR1可能是治療胃癌的一個新靶點(diǎn);(2)ATP競爭性FGFR抑制劑AZD4547在體內(nèi)外均表現(xiàn)出良好的抗胃癌增值效果;新型非ATP競