穩(wěn)定高表達FGFR1的A549細胞株的構(gòu)建及其生物活性的探究.pdf

1、目的：
　　近年來我國肺癌發(fā)病率及死亡率已居惡性腫瘤之首，不僅嚴重危害國民健康，而且對社會經(jīng)濟造成巨大損失，肺癌的治療難點亟待解決。bFGF/FGFR1信號通路在肺癌的發(fā)生與發(fā)展中扮演重要角色，以此為靶點的藥物是近年來的研究熱點。本研究通過構(gòu)建穩(wěn)定高表達FGFR1基因的A549細胞株并探究其對A549細胞生物活性的影響，為研究以FGFR1為靶點的抗肺癌藥物提供細胞模型。
　　方法：
　　通過構(gòu)建PCDH-FGFR1慢病

2、毒過表達載體，建立穩(wěn)定高表達FGFR1基因的A549細胞株，qRT-PCR，Western blot和免疫熒光鑒定過表達FGFR1的A549細胞株，同時制備bFGF單克隆抗體（bFGF mAb）。實驗分為7組：A549，A549/GFP。A549/FGFR1，A549/FGFR1+AP24534（FGFR1抑制劑），A549/FGFR1+bFGF。A549/FGFR1+bFGF mAb，A549/FGFR1+bFGF+bFGF mAb，

3、用MTT法、平板細胞克隆形成實驗、細胞粘附實驗、劃痕實驗、Transwell實驗檢測各實驗組細胞的增殖、粘附、侵襲和遷移能力，通過流式細胞儀檢測各實驗組細胞的周期和凋亡，Western blot檢測各實驗組PI3K/Akt/mTOR信號通路的變化。
　　結(jié)果：
　　經(jīng)酶切和基因測序鑒定，成功構(gòu)建了 PCDH-FGFR1慢病毒過表達載體；經(jīng)qRT-PCR、Western blot和免疫熒光實驗鑒定，成功構(gòu)建高表達 FGFR1基

4、因的A549細胞株，同時成功制備出bFGF mAb。bFGF和FGFR1可以使A549細胞由G1期向S期和G2期轉(zhuǎn)變，促進細胞的增殖并降低細胞的凋亡；AP24534和bFGF mAb可增加 A549 G1期細胞，抑制細胞生長并誘導細胞凋亡。bFGF和FGFR1可以增加A549細胞粘附、侵襲和遷移能力附能力，AP24534和bFGF mAb可抑制A549細胞粘附、侵襲和遷移能力。FGFR1和bFGF可促進Akt和mTOR磷酸化，激活PI3

5、K/Akt/mTOR信號通路，AP24534和bFGF mAb可以降低A549細胞的p-Akt和p-mTOR，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了穩(wěn)定高表達FGFR1基因的A549/FGFR1細胞株。bFGF和FGFR1可激活 PI3K/Akt/mTOR信號通路，并且促進 A549細胞增殖、粘附、侵襲和遷移、抑制細胞凋亡；bFGF mAb和AP24534可以抑制PI3K/Akt/mTOR信號通