LSD1對胃癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制及小分子抑制劑干預研究.pdf

1、表觀遺傳學是指在DNA序列不變的前提下基因表達或細胞表型的可遺傳變化，主要包括DNA甲基化，組蛋白共價修飾，染色質(zhì)重塑，基因沉默和RNA編輯。其中，組蛋白修飾涉及許多生理生物化學過程，可通過調(diào)控染色質(zhì)結構而激活或抑制基因表達。LSD1（HistoneLysineSpecificDemethylase1，組蛋白賴氨酸特異性去甲基化酶1）是2004年確認的第一個組蛋白去甲基化酶，可去除組蛋白H3K4、H3K9和非組蛋白底物賴氨酸的甲基而調(diào)控

2、其生物學功能。LSD1在多種腫瘤中高表達，用LSD1抑制劑或RNAi降低LSD1活性或表達量可抑制腫瘤生長。因此，獲得高效、低毒、高選擇性LSD1抑制劑是目前抗腫瘤藥物研究熱點。
　　LSD1作為MAO-A/B(MonoamineOxidaseA/B，單胺氧化酶A/B)同源蛋白，以FAD（FlavinAdenineDinucletide，黃素腺嘌呤二核苷酸）作為輔酶發(fā)揮其生物學功能。因此，許多通過與FAD相互作用而抑制MAO活性的

3、化合物亦可抑制LSD1活性，如2-PCPA（Tranylcypromine，苯環(huán)丙胺）。2010年有報道利用Click反應合成含三氮唑的MAO-A抑制劑，因此我們推測含1，2，3-三氮唑小分子MAO-A抑制劑對LSD1亦具有一定抑制活性。與此同時，二硫代甲酸酯類化合物由于其廣泛的抗菌和抗腫瘤活性亦吸引我們的注意力。因此，本課題利用Click反應和藥物設計中拼合原理，將1，2，3-三氮唑和氨基二硫代甲酸酯兩個活性片段拼合在一個分子之中，設

4、計并合成了一類含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯類化合物，檢測其對LSD1抑制活性，對其進行衍生化，獲得高效、高選擇性LSD1抑制劑，并深入研究其體外、體內(nèi)對腫瘤細胞增殖的抑制作用，抗腫瘤轉移和侵襲作用及作用機制。我們的研究結果和主要發(fā)現(xiàn)包括:
　　1)LSD1抑制劑篩選平臺的建立及LSD1抑制劑的設計與合成;
　　我們首先利用分子生物學方法構建了LSD1原核表達載體，并利用基因工程原核表達、分離純化出LSD1重組蛋白;同時為進行選

5、擇性篩選，我們亦分離純化了LSD1的另一同源蛋白LSD2。由于LSD1、LSD2去甲基化過程中可生成一分子過氧化氫，本研究使用熒光探針AmplexRed定量檢測LSD1、LSD2作用于組蛋白底物過程中生成過氧化氫，定量判斷LSD1、LSD2活性及我們設計合成的小分子化合物對其活性抑制作用，建立篩選平臺。同時開展了1，2，3-三氮唑-氨基二硫代甲酸酯類LSD1抑制劑研究。通過對設計、合成69個化合物活性篩選和生物活性評價以及構效關系分析，

6、發(fā)現(xiàn)一類具有全新結構的LSD1抑制劑，其中活性最好的是化合物30，其對LSD1抑制活性IC50為2.11μM。因此，以下研究以化合物30為主要研究對象開展。
　　2)LSD1抑制劑在重組蛋白水平對LSD1活性的調(diào)控作用及其選擇性研究;
　　我們通過體外酶活性篩選實驗證實:LSD1抑制劑化合物30可特異性作用于LSD1，而對LSD2抑制活性較弱，對MAO-A/B無抑制活性。通過稀釋法和透析法研究發(fā)現(xiàn)，化合物30可通過非共價鍵與

7、LSD1呈可逆性結合并抑制LSD1活性。酶動力學實驗揭示化合物30可能競爭性作用于LSD1輔酶FAD所在活性口袋，可能是通過將FAD擠出LSD1活性中心調(diào)節(jié)LSD1活性;另一方面，化合物30亦有可能作用于LSD1別構區(qū)，通過改變酶構象將輔酶FAD“擠出”LSD1從而調(diào)節(jié)酶活性。分子對接及分子動力學模擬實驗進一步預測化合物30是LSD1輔酶FAD競爭性抑制劑，化合物30可通過與LSD1形成分子間氫鍵占據(jù)FAD所在空穴位置，進而抑制FAD與

8、LSD1的結合和活性。
　　3)LSD1抑制劑在細胞水平對LSD1抑制活性、抑制腫瘤細胞增殖作用及其整體動物水平生物活性評價;
　　胃癌細胞MGC-803中，我們發(fā)現(xiàn)LSD1選擇性抑制劑化合物30可上調(diào)底物H3K4me1、H3K4me2和H3K9me2表達量，并特異性抑制LSD1高表達胃癌細胞系MGC-803、HGC-27細胞增殖，而對LSD1低表達胃黏膜正常細胞系GES-1和胃癌細胞系SGC-7901增殖無明顯抑制作用。同

9、時，化合物30可誘導MGC-803細胞凋亡并將細胞周期阻滯于G2/M期。整體動物水平實驗顯示，化合物30可抑制人胃癌MGC-803裸鼠皮下移植瘤生長，并顯示出較低毒副作用。
　　4)LSD1抑制劑抑制胃癌細胞轉移和侵襲作用及其作用機制研究;
　　劃痕實驗及transwell實驗證實，在低于最低誘導細胞凋亡濃度下，化合物30可抑制細胞轉移和侵襲。免疫共沉淀實驗顯示，化合物30可通過抑制LSD1與snai1相互作用，激活E-Ca

10、dherin啟動子，上調(diào)EMT標志蛋白E-Cadherin表達?；衔?0同時可抑制間質(zhì)細胞標志蛋白N-Cadherin表達，從而抑制腫瘤細胞轉移和侵襲。進一步Elisa實驗證實，LSD1抑制劑化合物30可抑制MGC-803中TGFβ1（TransformingGrowthFactorbeta1，轉化生長因子β1）表達，因此，我們推測化合物30通過調(diào)節(jié)LSD1活性及抑制TGFβ1表達，抑制腫瘤細胞EMT(epithelial-mesen

11、chymaltransition，上皮-間質(zhì)細胞轉變)過程，最終抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲。
　　5)胃癌細胞MGC-803及胃黏膜上皮細胞GES-1中TGFβ1對LSD1調(diào)控及作用機制;
　　TGFβ超家族是一類結構相似但功能不同的肽類物質(zhì)，其中TGFβ1含量最高并在癌癥發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在正常組織中TGFβ1扮演著抑癌基因作用，抑制腫瘤生長;而在腫瘤組織中，隨著腫瘤的惡化，TGFβ1可促進腫瘤生長。本課題研究發(fā)現(xiàn)胃

12、癌細胞MGC-803中，不同濃度TGFβ1可時間依賴性上調(diào)LSD1表達。分別應用ERK抑制劑tangeretin，NF-κB抑制劑bay11-7085，p300抑制劑C646與TGFβ1聯(lián)用均可抑制TGFβ1誘導的LSD1過表達，提示TGF-β1對LSD1的表達調(diào)控依賴上述ERK，NF-κB及p300調(diào)控通路。由于p300能夠作用于LSD1啟動子，我們應用螢光雙報告基因?qū)嶒炦M一步證實ERK、NF-κB、p300在TGFβ1誘導LSD1表

13、達上調(diào)過程中對LSD1啟動子活性的調(diào)節(jié)作用，因此推測TGFβ1可能通過激活ERK使其磷酸化，進而激活NF-κB使其亞基p65入核并被磷酸化，從而招募轉錄因子p300作用于LSD1啟動子區(qū)，激活LSD1啟動子并時間依賴性上調(diào)LSD1表達。而對正常胃黏膜上皮細胞GES-1，TGFβ1可失活ERK，從而阻斷NF-κB激活，抑制p65的磷酸化，對LSD1表達無影響。
　　通過上述研究工作，本課題共合成69個含三氮唑的氨基二硫代甲酸酯類化合

14、物。并對其開展了LSD1活性篩選和評價，對化合物30開展了重點研究?；衔?0可逆性抑制LSD1活性，選擇性抑制LSD1高表達胃細胞系MGC-803和HGC-27增殖，并可通過抑制細胞EMT過程抑制腫瘤細胞轉移和侵襲。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞MGC-803中TGFβ1激活ERK，NF-κB信號通路，招募p300激活LSD1啟動子，上調(diào)LSD1表達。而胃黏膜上皮細胞中，TGFβ1對LSD1表達無調(diào)節(jié)作用。
　　本研究首次報道可同時抑