MEK抑制劑和ANTI-TIM3抑制黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 Anti—TIIM3以及MEK抑制劑對(duì)黑色素瘤免疫功能以及增殖凋亡的影響
　　目的：評(píng)估抗T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-3（Anti-Tcellimmunoglobulinmucin-3,Anti-Tim3）和絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activatedERK-regulatingkinase,MEK)抑制劑在黑色素瘤中的抗腫瘤效果。
　　方法：建立小鼠黑色素瘤模型后分

2、組給藥（第一組：Control；第二組：Anti-TIM3；第三組：MEK抑制劑GSK1120212組；第四組：Anti-TIM3+GSK1120212聯(lián)合組）從小鼠黑色素瘤模型中提取單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組小鼠PBMC中淋巴細(xì)胞亞群和IL-17a的數(shù)量變化，同時(shí)使用CCK-8，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各實(shí)驗(yàn)組對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10增殖，遷徙的影響，評(píng)估MEK抑制劑多種給藥途徑產(chǎn)生的抗腫瘤效果。
　　結(jié)果：

3、流式檢測結(jié)果顯示Anti-Tim3組，GSK1120212組，Control組，GSK1120212+Anti-TIM3聯(lián)合組CD8+（％）比例分別為（66±5（%）；31±4.5（%）；35±4（%）；44±4（%）），IL-17a比例分別為（14.5±2.8（%）；3±1.1（%）；3.1±1.3（%）；8.9±2.6（%）），提示Anti-Tim3與空白組相比可上調(diào)小鼠黑色素瘤PBMC中CD8+T細(xì)胞數(shù)量(***P<0.01，有顯

4、著性意義）以及IL-17a水平(*P<0.05，有顯著性意義）。小鼠生存實(shí)驗(yàn)中GSK1120212組對(duì)小鼠黑素瘤體積的抑制率達(dá)到30%(***P<0.01;n=5，有顯著性意義)，而GSK1120212+Anti-TIM3聯(lián)合組對(duì)小鼠黑素瘤體積的抑制率達(dá)到40.8%(***P<0.01;n=5，有顯著性意義)。相比之下，Anti-TIM3組雖也對(duì)小鼠黑色素瘤發(fā)生發(fā)展起到了一定抑制作用（**P<0.01;n=5，有顯著性意義），但是在腫瘤

5、生長大小上的抑制效應(yīng)并沒有GSK1120212組以及GSK1120212+Anti-TIM3聯(lián)合組來的明顯。CCK-8,劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，在GSK1120212以及聯(lián)合組作用下的B16F10增殖，遷徙能力明顯減弱，而Anti-TIM3組與Control組作用下細(xì)胞增殖，遷徙活力并無顯著性差異。給藥4h時(shí)，CCK-8結(jié)果顯示，GSK1120212以及聯(lián)合組對(duì)B16F10細(xì)胞株增殖活性的抑制達(dá)到了最高峰21%，24%（**P＜0.01，有顯著性

6、意義），此后隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞增殖抑制能力依次遞減，至36h時(shí)藥物對(duì)B16F10增殖活力的抑制幾乎完全消失。在比較GSK1120212不同給藥途徑抗腫瘤效果差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，灌胃組與空白組相比較，其腫瘤大小的抑制效率大于30%（***P＜0.01，有顯著性意義），而皮下注射和腹腔注射兩組抑制率約15%。
　　結(jié)論：Anti-TIM3和MEK抑制劑在黑色素瘤的抗腫瘤效應(yīng)中存在著協(xié)同作用。其中Anti-Tim3可恢復(fù)CD8+T細(xì)胞活性。M

7、EK抑制劑促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞凋亡并抑制其增殖，遷徙。提示Anti-TIM3和MEK抑制劑的抗腫瘤機(jī)制不同，但同時(shí)可能又存在著一定的關(guān)聯(lián)。
　　第二部分 MEK下調(diào)對(duì)TIM3表達(dá)的影響
　　目的：通過下調(diào)MEK表達(dá)探尋TIM3水平變化。
　　方法：建立小鼠黑色素瘤模型后分組給藥（第一組：Control；第二組：GSK1120212組）從小鼠黑色素瘤模型中提取PBMC,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測各實(shí)驗(yàn)組小鼠PBMC中各淋巴細(xì)胞亞群上

8、TIM3水平變化，觀察PMA刺激對(duì)體外人急性T淋巴細(xì)胞白血?。↗urkat）細(xì)胞表面TIM3表達(dá)的影響，同時(shí)通過Si-h-MEK2質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染JurkatT細(xì)胞來比較MEK2沉默與正常狀態(tài)下TIM3的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：GSK1120212阻斷小鼠黑色素瘤模型中MEK后，CD8+T細(xì)胞TIM3表達(dá)水平增高（GSK1120212組CD8+TIM3+比例17.6±2（%），對(duì)照組CD8+TIM3+比例5.95±3.7（%），**P

9、＜0.01，有顯著性意義）。而CD4，NK表達(dá)TIM3水平與對(duì)照組相比并無顯著性差異。JurkatT細(xì)胞經(jīng)過PMA刺激后活化，表達(dá)TIM3水平增高（*P＜0.05，有顯著性意義）.RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了Si-h-MEK2的Jurkat細(xì)胞中TIM3的mRNA和蛋白水平表達(dá)較對(duì)照組顯著升高（流式結(jié)果顯示，Si-h-MEK2組JurkatT細(xì)胞TIM3+比例15.5±2.5（%）,Control組TIM3+比例4.9±2