B19靶向抑制TrxR1蛋白上升ROS發(fā)揮抗胃癌活性及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　B19是我們前期研究中發(fā)現(xiàn)的單羰基姜黃素類似物，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制活性，主要通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。但它的直接作用靶點(diǎn)尚不明確，它對(duì)胃癌的作用也尚無(wú)報(bào)道?；钚匝醮兀≧OS）作為化學(xué)活性分子在機(jī)體中發(fā)揮著重要的作用，過(guò)多地增加ROS的產(chǎn)生會(huì)引起細(xì)胞脂質(zhì)氧化、DNA損傷，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TrxR1是調(diào)節(jié) ROS的重要蛋白酶，我們前期研究發(fā)現(xiàn)其在人胃癌組織中高表達(dá)。同時(shí)，前期研究還發(fā)現(xiàn)B19在胃癌細(xì)胞中能

2、夠明顯誘導(dǎo)凋亡、上調(diào)ROS水平，并伴隨著對(duì)TrxR1活性的抑制。因此，我們推測(cè)B19可能是通過(guò)靶向TrxR1來(lái)上調(diào)ROS水平，發(fā)揮抗胃癌作用。本實(shí)驗(yàn)的目的就是確證TrxR1為B19的直接作用靶點(diǎn)，闡明B19抗胃癌的分子機(jī)制，同時(shí)為T(mén)rxR1作為胃癌治療的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)
　　方法：
　　通過(guò)表面等離子共振（SPR）實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證B19與人TrxR1蛋白體外相互作用。再利用分子對(duì)接模擬技術(shù)（Molecular docking si

3、mulation）尋找TrxR1與B19的結(jié)合位點(diǎn)。再進(jìn)一步利用DTNB還原法和胰島素終點(diǎn)法分別測(cè)定了B19對(duì)人TrxR1蛋白以及胃癌細(xì)胞株中TrxR1的活性抑制作用。通過(guò)流式細(xì)胞儀利用ROS探針(DCFH-DA)檢測(cè) B19處理后人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，BGC-823和KATO-III中的相應(yīng)ROS的水平。用MTT法、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)B19對(duì)人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，BGC-823和KATO-III

4、的抑制活性，并驗(yàn)證ROS在其中的作用。并利用Western blot和免疫熒光法檢測(cè)B19作用后胃癌細(xì)胞內(nèi)與ROS密切相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體凋亡通路的相關(guān)蛋白變化。并進(jìn)一步使用電鏡直接觀察B19作用后胃癌細(xì)胞內(nèi)的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)改變。最后用裸鼠皮下移植瘤模型驗(yàn)證B19的抗胃癌活性，并進(jìn)一步檢測(cè)給藥后移植瘤內(nèi)TrxR1活性以及其它相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　結(jié)果：
　　表面等離子共振（SPR）實(shí)驗(yàn)顯示B19能夠與TrxR1發(fā)生直接相

5、互作用。分子對(duì)接模顯示B19可以和人TrxR1蛋白活性中心Cys-498側(cè)鏈形成共價(jià)結(jié)合，中間連接鏈羰基上的氧原子可以和W407側(cè)鏈形成較多的氫鍵作用。DTNB還原法和胰島素終點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)顯示B19可以濃度依賴性地抑制TrxR1蛋白的還原酶活性。我們利用ROS探針發(fā)現(xiàn)B19可以時(shí)間依賴地和濃度依賴地上升胃癌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，并且ROS清除劑（NAC）可以基本逆轉(zhuǎn)ROS的上升。MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)顯示B19可以濃度依賴地抑

6、制人胃癌細(xì)胞（SGC-7901，BGC-823和KATO-III）的增殖，誘導(dǎo)G2/M阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Western Blot、免疫熒光實(shí)驗(yàn)和電鏡結(jié)果顯示 B19可以時(shí)間依賴地和濃度依賴地激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白（ATF4、CHOP、p-eIF2α和p-PERK）和降低細(xì)胞內(nèi)Bcl-2/Bax蛋白比例，降低線粒體膜電位電勢(shì)，進(jìn)一步引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體腫脹，而且ROS清除劑（NAC）可以基本逆轉(zhuǎn)上述效果。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示B19具有良好的抗胃癌

7、活性，而且較大劑量的B19對(duì)小鼠無(wú)明顯毒性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)B19抑制移植瘤內(nèi) TrxR1蛋白酶活性，并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體紊亂信號(hào)通路相關(guān)蛋白。
　　結(jié)論：
　　TrxR1蛋白在胃癌組織中較其癌旁組織明顯高表達(dá)，可以作為治療胃癌的潛在靶點(diǎn)。單羰基姜黃素類似物B19通過(guò)靶向抑制TrxR1蛋白還原酶活性，上升腫瘤細(xì)胞內(nèi) ROS水平，發(fā)揮抗胃癌活性。B19上升腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平后，細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的ROS激活下游內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)