胃癌血管靶向性蛋白GX1-TNF的表達(dá)、純化及生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、本文研究目的：為了進(jìn)一步提高人腫瘤壞死因子(rmhTNF)的療效，降低毒副作用同時(shí)降低用量，將GX1肽融合在rmhTNF的N末端，構(gòu)建了GX1-rmhTNF，旨在使該融合蛋白能特異性地作用于腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，改變內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，更好的殺死腫瘤細(xì)胞。 研究方法和結(jié)果：首先采用DNA重組技術(shù)正確構(gòu)建了含GX1-rmhTNFα融合基因的原核表達(dá)載體pBV-GX1-rmhTNFα，含該表達(dá)載體的EscherichiacoliDH

2、5α經(jīng)42度溫度誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，表達(dá)量占菌體可染蛋白的7％左右，超聲裂菌后SDS-PAGE顯示上清和沉淀都有表達(dá)，將裂菌上清加固體硫酸銨至30％飽和度，收集上清。再加固體硫酸銨至60％飽和度，收集沉淀，分別過(guò)SP-SepharoseFastFlow和Q-sepharoseFastFlow層析純化，收集洗脫峰，按經(jīng)典的L929細(xì)胞毒法進(jìn)行活性測(cè)定，目的蛋白對(duì)L929細(xì)胞殺傷活性為5x106IU/ml。將各階段樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳。

3、用鼠抗人TNF抗體為一抗，酶標(biāo)兔抗鼠IgG為二抗，進(jìn)行westernblot和分析，證實(shí)純化的GX1-rmhTNFα在溶液中以單體、二聚體、三聚體的混合形式存在。對(duì)純化樣品進(jìn)行HPLC分析，純度大于95％。用裸鼠皮下種植胃癌SGC7901細(xì)胞成瘤動(dòng)物模型觀察GX1-rmhTNFα的體內(nèi)分布情況，ELISA檢測(cè)組織上清TNF顯示目的蛋白比對(duì)照蛋白更能靶向結(jié)合于腫瘤組織，是對(duì)照組織的2.35-12.19倍，注射后2h在腫瘤仍保持高濃度。給藥

4、GX1-rmhTNFα，觀察腫瘤生長(zhǎng)大小及裸鼠體重變化情況，結(jié)果顯示GX1-rmhTNFα從注射17天起即明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，與對(duì)照藥物rmhTNFα相比，其全身毒副作用明顯降低。 研究結(jié)論：本研究克隆并表達(dá)了GX1-rmhTNFα，經(jīng)過(guò)純化得到了具有生物學(xué)活性的重組蛋白，該蛋白能靶向結(jié)合于腫瘤組織，抑制腫瘤生長(zhǎng)，并有較低的全身毒副作用。為GX1-rmhTNFα重組蛋白工業(yè)化生產(chǎn)和提供新的腫瘤血管抑制藥物奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。