腫瘤血管靶向肽GX1用于胃癌的分子影像研究.pdf

1、背景：
　　胃癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率居高不下，給我國造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其防治的關(guān)鍵是早發(fā)現(xiàn)早治療，而我國胃癌的早診率較低，致使病人確診時已是中晚期，延誤了手術(shù)時機(jī)。分子影像的出現(xiàn)為胃癌的診治提供了新的思路，其關(guān)鍵是找到一個具有靶向特異性的分子。腫瘤血管靶向多肽的研究應(yīng)用是目前國際公認(rèn)的有效方法，利用噬菌體肽庫篩選出腫瘤血管靶向肽有些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗階段，具有良好的應(yīng)用價值。
　　我課題組一直致力于胃癌血管生

2、成的研究，并在前期篩選出了腫瘤血管靶向性多肽GX1，研究顯示其可以特異性地與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，并在體內(nèi)具有一定的腫瘤靶向作用。利用GX1我們制備了一系列探針或藥物，在胃癌的診斷和治療方面做了大量研究，顯示出了GX1的應(yīng)用前景。但是GX1的親和力及靶向性仍不足，我們又對其進(jìn)行了修飾，以期彌補(bǔ)這些不足。本文即是將GX1制成二聚體，利用多種方法鑒定其體內(nèi)外的特征，為胃癌的診治提供一條新的思路。
　　目的：
　　1)合成GX1的

3、二聚體，鑒定其是否親和力及靶向性優(yōu)于單體；
　　2)摸索188Re的標(biāo)記方法，制備188Re-PEG-(GX1)2，將其用于胃癌的SPECT成像，研究其用于胃癌診斷及治療的可行性；
　　3)摸索68Ga的標(biāo)記方法，制備68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2，將其用于胃癌的PET成像，研究其用于胃癌診斷的可行性；
　　方法：
　　1)制備188Re-PEG-(GX1)2并做質(zhì)量鑒定，測定標(biāo)記率和穩(wěn)定性；體外細(xì)胞結(jié)

4、合分析及競爭性抑制實(shí)驗驗證188Re-PEG-(GX1)2與Co-HUVECs結(jié)合的特異性，判斷GX1二聚體的親和力是夠增加；MTT分析及流式細(xì)胞術(shù)驗證188Re-PEG-(GX1)2抑制Co-HUVECs增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；
　　2)荷瘤裸鼠的SPECT成像及T/H定量驗證188Re-PEG-(GX1)2的在體靶向性；BLI監(jiān)測荷瘤裸鼠的腫瘤生長，判斷188Re-PEG-(GX1)2的治療效果；
　　3)離體腫瘤組織

5、的CD31染色、Ki67染色、TUNEL等驗證188Re-PEG-(GX1)2抑制腫瘤血管生成、抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用；對肝、腎的HE染色及生化分析判斷188Re-PEG-(GX1)2對肝、腎功能的影響。
　　4)制備68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2并做質(zhì)量鑒定，測定標(biāo)記率和穩(wěn)定性；體外細(xì)胞結(jié)合分析及競爭性抑制實(shí)驗驗證68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2與Co-HUVECs結(jié)合的特異性；細(xì)胞免疫熒光和攝取及外排實(shí)驗

6、判斷GX1二聚體的親和力是夠增加；
　　5) Nano PET/CT成像、SUV值定量、生物學(xué)分布等實(shí)驗驗證68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2在荷瘤裸鼠體內(nèi)的腫瘤靶向性，定量分析其在體分布。結(jié)果：
　　1)成功制備了188Re-PEG-(GX1)2，標(biāo)記率大于96％，在血清中72 h穩(wěn)定存在；體外細(xì)胞結(jié)合分析及競爭性抑制實(shí)驗結(jié)果表明188Re-PEG-(GX1)2能夠與Co-HUVECs特異性結(jié)合，且親和力高于188R

7、e-GX1和188Re-URP；MTT分析和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果證實(shí)188Re-PEG-(GX1)2在體外可有效抑制Co-HUVECs增殖、誘導(dǎo)Co-HUVECs凋亡，作用效果優(yōu)于188Re-GX1和188Re-URP；
　　2) SPECT成像結(jié)果證實(shí)188Re-PEG-(GX1)2在荷瘤裸鼠體內(nèi)具有良好的胃癌靶向性，T/H比值高于188Re-GX1；BLI監(jiān)測荷瘤裸鼠治療過程中的腫瘤變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)188Re-PEG-(GX1)2在體

8、內(nèi)具有抑制腫瘤增殖的效果，且效果優(yōu)于188Re-GX1；
　　3)對離體腫瘤組織的CD31、Ki67、TUNEL染色，結(jié)果表明與188Re-GX1相比，188Re-PEG-(GX1)2在體內(nèi)更能抑制腫瘤血管新生、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；HE染色及生化分析結(jié)果表明探針在體內(nèi)未對肝腎形態(tài)及功能造成可見的影響；
　　4)成功制備了68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2，標(biāo)記率大于97%，在血清中90 min穩(wěn)定存在

9、；體外細(xì)胞受體結(jié)合分析及競爭性抑制實(shí)驗結(jié)果表明，68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2與Co-HUVECs的結(jié)合高于HUVEC、BGC823和GES等細(xì)胞，說明該探針特異性地與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合；同時該實(shí)驗結(jié)果也表明68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2與Co-HUVECs的結(jié)合高于68Ga-DOTA-GX1，說明二聚體確實(shí)提高了GX1的親和力；細(xì)胞免疫熒光證實(shí)，KEK-(GX1)2與Co-HUVECs的結(jié)合明顯高于單體GX1；細(xì)

10、胞的攝取和外排實(shí)驗證明，Co-HUVECs攝取68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2高于68Ga-DOTA-GX1，并且在60 min時達(dá)到最大；
　　5) Nano PET/CT成像結(jié)果顯示，注射68Ga-DOTA-KEK-(GX1)2的裸鼠腫瘤顯像清晰，腫瘤部位的SUV值明顯高于注射68Ga-DOTA-GX1的裸鼠，說明探針的體內(nèi)靶向性較好；最后我們用生物學(xué)分布定量地觀察探針在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果顯示當(dāng)腎臟和肝臟等器官快

11、速代謝的時候，注射68Ga-DOTA-GX1的裸鼠腫瘤部位放射性有相對緩慢的下降；同時，在60 min時除了肝腎以外，腫瘤部位的%ID/g超過其他正常器官，結(jié)果說明腫瘤對探針有較好的吸收。
　　結(jié)論：
　　1)對GX1的修飾成功，GX1二聚體的體內(nèi)外屬性明顯優(yōu)于單體；
　　2)成功制備了既能用于胃癌診斷也能用于胃癌治療的診療一體化探針188Re-PEG-(GX1)2，具有胃癌診療的應(yīng)用前景；
　　3)成功制備了胃