131I標記酪氨酸(Tyr)修飾的腫瘤血管靶向肽GX1用于分子影像及體外放射治療研究.pdf

1、【背景】
　　胃腸道腫瘤是危害人類健康的最常見惡性腫瘤,多數(shù)患者就診時病情多已處于進展期或晚期,因缺乏其他有效的治療方式,以往對其的治愈率一直很低,醫(yī)學(xué)科學(xué)者也在積極不斷的探索和嘗試新的有效治療腫瘤的方法。1971年,Folkman教授提出的“腫瘤生長依靠新生血管生成的學(xué)說”[1-2]開創(chuàng)了腫瘤治療的新領(lǐng)域,隨后,圍繞腫瘤新生血管抑制療法研制和篩選出了許多抗體和多肽,但一直缺乏一種特別有效的靶向分子或短肽同時用于腫瘤的診斷和治療。

2、
　　近年來隨著分子影像研究技術(shù)的發(fā)展,放射性核素標記小分子多肽或單克隆抗體在腫瘤的顯影和治療中已成為更具優(yōu)勢的候選分子,尤其是采用治療性放射性核素標記靶向性小肽或單抗進行放射治療更具前景。GX1短肽是我科郅敏等人[3]于2004年利用噬菌體環(huán)7肽庫體內(nèi)篩選技術(shù)從人胃癌的小鼠腎包膜下異種移植瘤模型中篩選出的環(huán)狀小肽(氨基酸序列為CGNSNPKSC)。前期各種體內(nèi)外實驗研究[3-7]表明該短肽具有與腫瘤血管內(nèi)皮細胞靶向結(jié)合的能力,但

3、以往的研究著重于GX1性質(zhì)的鑒定、PEG修飾和99Tcm標記該短肽與腫瘤血管內(nèi)皮細胞靶向性的研究,而用131I標記并用于顯影和治療方面的研究還尚未進行,故本課題設(shè)計、合成酪氨酸(Tyr)修飾的GX1短肽,研究131I標記該修飾短肽(Tyr-GX1)在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分子影像和體外放射治療研究,以探討將其應(yīng)用于體內(nèi)靶向腫瘤血管顯像和診治藥物的可能性。
　　【目的】
　　1、化學(xué)合成Tyr-GX1短肽,并對其化學(xué)性質(zhì)、受體結(jié)合性、

4、靶向性等進行質(zhì)量鑒定,評價其是否與GX1短肽的性質(zhì)一致。
　　2、用131I標記Tyr-GX1短肽,制備131I-Tyr-GX1同位素探針,并對其標記率、穩(wěn)定性、放化純等性質(zhì)進行鑒定,隨后進行SPECT成像和Cerenkov光學(xué)成像,評估該探針在體內(nèi)對腫瘤血管的靶向性。
　　3、初步評估131I-Tyr-GX1短肽在體外細胞水平是否對共培養(yǎng)內(nèi)皮細胞有放射抑制作用。
　　【方法】
　　1、根據(jù)氨基酸序列人工化學(xué)合成

5、Tyr修飾的GX1短肽,并進行質(zhì)譜分析、化學(xué)性質(zhì)等鑒定;制備生物素標記的Tyr-GX1短肽,細胞免疫熒光實驗觀察其在內(nèi)皮細胞(HUVEC)/共培養(yǎng)內(nèi)皮細胞(Co-HUVEC)的結(jié)合表達情況,根據(jù)細胞結(jié)合的熒光強度評價其對不同細胞的結(jié)合特異性;隨后用直接標記法將放射性核素99mTc與Tyr-GX1或GX1短肽標記,尾靜脈注射入不同皮下接種SGC7901/Lovo腫瘤細胞的裸鼠模型體內(nèi),在不同時間點(4h、8h、12h、18h、24h)觀察

6、SPECT成像,利用計算機勾劃感興趣區(qū)(ROI)技術(shù),計算不同時間點腫瘤組織與非腫瘤組織的放射性比值(T/NT),進而來證實該修飾肽(Tyr-GX1)在體內(nèi)的腫瘤血管靶向性。
　　2、應(yīng)用Iodogen碘標法直接將131I與Tyr-GX1短肽進行標記,并對其進行標記率、穩(wěn)定性及放化純等性質(zhì)分析,24h不同時間點SPECT成像和Cerenkov光學(xué)成像及生物學(xué)分布檢測,觀察131I-Tyr-GX1短肽是否在荷瘤裸鼠體內(nèi)具有較好的腫瘤

7、血管靶向性。
　　3、體外細胞實驗,應(yīng)用流式細胞術(shù)(FCM)、MTT法檢測131I-Tyr-GX1短肽在不同濃度下對Co-HUVEC的放射抑制作用。
　　【結(jié)果】
　　1、質(zhì)譜分析結(jié)果表明合成的短肽確實為Tyr-GX1短肽。細胞免疫熒光結(jié)果顯示:Tyr-GX1與Co-HUVEC和HUVEC明顯結(jié)合,而與SGC7901細胞和GES細胞結(jié)合較弱;在Co-HUVEC上,Tyr修飾的GX1和單獨的GX1結(jié)合差異不明顯,而與對照

8、組URP相比,差異比較明顯。99Tcm分別標記Tyr-GX1、GX1,測定標記率后,尾靜脈注射入不同荷結(jié)腸癌裸鼠體內(nèi),24小時SPECT顯像結(jié)果顯示:99Tcm-Tyr-GX1與99Tcm-GX1顯像結(jié)果基本相似,裸鼠腫瘤部位從4h開始已顯影,于12h和18h最清楚,與99Tcm-URP相比,腫瘤部位攝取明顯高于URP對照組,說明Tyr-GX1與GX1相比,也同樣具有良好的腫瘤血管靶向性;24h體內(nèi)生物學(xué)分布顯示:99Tcm標記的Tyr

9、-GX1/GX1主要分布在腎臟、肝臟和腫瘤,高于其他組織器管,這提示Tyr-GX1和GX1一樣都是通過腎臟代謝排出體外;24h時腫瘤組織與非腫瘤組織(肌肉、腦、血液、肝臟、腎臟)的放射性比值(T/NT)顯示,腫瘤組織的放射性聚集明顯高于腦、肌肉等非腫瘤組織。綜上實驗結(jié)果說明:Tyr修飾的GX1和單獨的GX1在結(jié)合內(nèi)皮細胞、靶向性等方面性質(zhì)沒有發(fā)生變化。
　　2、Iodogen碘標法結(jié)果顯示:131I標記Tyr-GX1的標記率>90

10、％、比活度計算為30ci/mmol(>10ci/mmol)、放化純>90%,24h不同時間點其穩(wěn)定性檢測,結(jié)果顯示:至24h時,131I-Tyr-GX1的標記率在不同溶液中(人血清、鼠血清、PBS、過量EDTA溶液)仍都維持在90﹪左右,表明131I-Tyr-GX1短肽在體內(nèi)外具有良好的穩(wěn)定性。隨后,我們將131I-Tyr-GX1尾靜脈注射入荷瘤裸鼠體內(nèi)進行雙模態(tài)成像,24h動態(tài)SPECT成像顯示:腫瘤于12-18h時顯影較好,與同條件

11、下對照組131I-Tyr-RGD相比,具有相似顯影結(jié)果;體內(nèi)24h生物學(xué)分布顯示:標記肽(131I-Tyr-GX1)在荷瘤裸鼠雙腎放射性計數(shù)測量最高,其次是肝臟、腫瘤等組織,腦、骨、肌肉等組織放射性計數(shù)含量較低;同時,Cerenkov光學(xué)成像結(jié)果顯示荷瘤裸鼠腹腔部位和腫瘤部位顯影,結(jié)果與SPECT結(jié)果基本一致。
　　3、體外細胞抑制和凋亡實驗結(jié)果顯示:Na131I、Tyr-GX1、131I-Tyr-GX1在不同濃度下對Co-HUV

12、EC產(chǎn)生一定的抑制作用,且具有劑量濃度依賴關(guān)系,其中131I-Tyr-GX1的作用較強,并在高濃度下對Co-HUVEC有一定的促凋亡和放射殺傷作用。
　　【結(jié)論】
　　1、成功設(shè)計、合成了單個氨基酸——酪氨酸(Tyr)修飾的GX1短肽,經(jīng)體內(nèi)外實驗驗證,Tyr-GX1在化學(xué)性質(zhì)、結(jié)合內(nèi)皮細胞、腫瘤血管靶向性等方面性質(zhì)與GX1相比沒有發(fā)生變化;
　　2、應(yīng)用Iodogen碘標法成功標記了Tyr-GX1短肽,并獲得了具有較