腫瘤血管靶向肽GX1的PEG修飾及其在胃腸道腫瘤的分子影像研究.pdf

1、背景：
　　胃腸道腫瘤呈世界高發(fā)的流行趨勢，傳統(tǒng)治療方法在提高治愈率方面療效甚微，醫(yī)學(xué)研究者不斷地探索新的治療方法，以期攻克腫瘤，尤其是惡性胃腸道腫瘤。1971年，F(xiàn)olkman提出腫瘤的生長依賴血管生成的理論，這為腫瘤的抗血管生成治療開辟了道路。此后，圍繞這一領(lǐng)域展開了大量廣泛且深入的研究，但缺少能與腫瘤血管特異性結(jié)合且體內(nèi)具有靶向到腫瘤血管的異質(zhì)性分子是這一治療手段前進的瓶頸。
　　實驗室一直致力于該領(lǐng)域研究，積極尋找腫

2、瘤血管特異的靶向性分子，并于2004年利用噬菌體隨機肽庫技術(shù)在荷人胃癌裸鼠模型經(jīng)過體內(nèi)4輪淘篩，篩選出環(huán)狀九肽GX1。前期研究顯示，GX1可與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合，具有良好的體內(nèi)靶向性。但其與受體親和力和體內(nèi)的藥代動力學(xué)還有待改善。文獻報道，PEG修飾可以改善多肽類藥物的生物學(xué)活性，具有諸多優(yōu)點。故實驗室利用叉形mPEG5000制備GX1的二聚體和四聚體，以期能彌補GX1的不足之處。
　　目的：
　　1.用PEG修飾G

3、X1，制備GX1的多聚體，篩選出最佳的修飾肽。
　　2.對篩選出來的修飾肽進行體內(nèi)外鑒定，評價其是否優(yōu)于GX1。
　　方法：
　　1.利用叉形PEG交聯(lián)的方法，得到PEG化GX1二聚體[ PEG-(GX1)2]和四聚體[ PEG-(GX1)4]，放射性同位素99mTc標(biāo)記后利用SPECT顯像篩選出擁有最佳腫瘤血管靶向性的短肽。
　　2.制備生物素化的PEG-(GX1)2，細(xì)胞免疫熒光觀察其在共培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的表達及

4、定位，通過不同細(xì)胞的熒光強度評價其對細(xì)胞的特異性；99mTc直接標(biāo)記法標(biāo)記 PEG-(GX1)2，利用體外受體放射配基結(jié)合分析及競爭性抑制實驗和受體飽和分析來評價其與受體的親和力及對腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性；裸鼠皮下接種SGC7901或LoVo細(xì)胞，尾靜脈注射標(biāo)記肽，利用SPECT觀察腫瘤位置在0.5 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h等時間點的顯像，并用計算機勾畫感興趣區(qū)（ROI），計算各個時間點的腫瘤與心臟放射性的比值

5、，以此來觀察標(biāo)記肽在體內(nèi)的靶向性。
　　3.利用生物學(xué)分布定量計算標(biāo)記肽在體內(nèi)的分布，評價其在體內(nèi)是否具有腫瘤靶向作用。
　　結(jié)果：
　　1.使用叉形 mPEG5000交聯(lián)的方法，成功制備了PEG-(GX1)2和PEG-(GX1)4。放射性同位素99mTc標(biāo)記，然后利用SPECT顯像篩選出了擁有最佳腫瘤血管靶向性的短肽PEG-(GX1)2。
　　2.免疫熒光結(jié)果顯示，PEG-(GX1)2與 Co-HUVEC的結(jié)合

6、高于 GX1與Co-HUVEC的結(jié)合，也高于 PEG-(GX1)2與 HUVEC的結(jié)合，而PEG-(GX1)2與SGC7901、LoVo、GES和HIEC細(xì)胞不結(jié)合，URP與Co-HUVEC也不結(jié)合。同時，共聚焦顯微鏡還觀察到PEG-(GX1)2表達于Co-HUVEC的胞漿，核周表達最高。體外受體放射配基結(jié)合分析及競爭性抑制實驗顯示，99mTc-PEG-(GX1)2與 Co-HUVEC的結(jié)合高于HUVEC，也高于99mTc-GX1與Co

7、-HUVEC的結(jié)合，并可被GX1競爭性抑制，但與腫瘤細(xì)胞或正常粘膜上皮細(xì)胞不結(jié)合。受體飽和分析顯示99mTc-PEG-(GX1)2與 Co-HUVEC的結(jié)合高于 HUVEC，兩條曲線均呈飽和曲線，說明 PEG-(GX1)2與兩種細(xì)胞結(jié)合屬于受體特異性結(jié)合。SPECT顯像結(jié)果可以看出，腫瘤組織對99mTc-PEG-(GX1)2的吸收明顯高于99mTc-GX1，并且延長了腫瘤的滯留率，腎的吸收減弱，體內(nèi)藥代動力學(xué)得到改善，而對99mTc-U

8、RP無吸收；并且注射99mTc-PEG-(GX1)2的瘤心比大于注射99mTc-GX1的，說明隨著血液中放射性的逐漸清除，腫瘤中的放射性有聚集的趨勢。
　　3.生物學(xué)分布進一步證實了SPECT顯像的結(jié)果。以上結(jié)果均說明PEG-(GX1)2的親和力、特異性及靶向性均優(yōu)于GX1。
　　結(jié)論：
　　PEG修飾的GX1二聚體可以明顯提高短肽的特異性、結(jié)合力和靶向性，體內(nèi)藥代動力學(xué)明顯改善。99mTc-PEG-(GX1)2是一個