131I標記新型靶向FGF8分子探針的制備及其對前列腺癌細胞體外作用影響的實驗研究.pdf

1、目的：探索131I標記靶向成纖維生長因子8（FGF8）小分子多肽HSQAAVP（組氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-丙氨酸-纈氨酸-脯氨酸）的最佳條件，并獲得放射化學純度大于95％的標記產(chǎn)物131I–HSQAAVP。研究131I–HSQAAVP體外穩(wěn)定性及生物學活性；研究鑒定標記產(chǎn)物131I-HSQAAVP在體外對前列腺癌LNCaP、DU145細胞殺傷作用。
　　方法：采用氯胺-T法對多肽HSQAAVP進行131I標記，通過正交實驗篩選最優(yōu)

2、標記條件。選Sephadex G25凝膠層析柱對標記混合液分離純化得到標記產(chǎn)物131I-HSQAAVP，用薄層層析技術(shù)（TLC）測定其標記率及放射化學純度。將分離純化的新型分子探針131I-HSQAAVP（放射化學純度大于95％）分別放置于室溫及加入人血清后，在37℃條件下，放置24小時，分別測定不同時間段其放射化學純度，觀察其穩(wěn)定性。體外培養(yǎng)前列腺癌LNCaP細胞及DU145細胞，用CCK-8法對人前列腺癌細胞系LNCaP、DU145

3、進行增殖抑制實驗，分別計算HSQAAVP以及131I-HSQAAVP對LNCaP、DU145細胞的抑制率，判斷131I-HSQAAVP的生物學活性。在培養(yǎng)好的前列腺癌LNCaP細胞、DU145細胞株中，分別加入不同放射性活度的131I-HSQAAVP、131I、以及與標記肽相同濃度的HSQAAVP，并設(shè)置空白對照組，干預(yù)48h后，應(yīng)用光學顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細胞分析來鑒定131I-HSQAAVP對前列腺癌LNCaP細胞及DU1

4、45細胞株的殺傷作用。
　　結(jié)果：最佳標記條件中，室溫條件下(25℃)，在反應(yīng)體系50μL0.5mol/L pH7.4的PBS緩沖液中投入HSQAAVP50μg與131I74.0Mbq（2mCi），再加入10μL(1mg/mL)的氯胺-T,振蕩反應(yīng)5min,用20μL(2 mg/mL)偏重亞硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，得到標記率(71.5±3.03)%的標記混合液。經(jīng)柱分離純化后，放化純可達到95%以上。體外穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，131I-

5、HSQAAVP分別在25℃和加入人血清后，37℃條件下放置24h后，測得其放射化學純度均大于90%。131I-HSQAAVP和HSQAAVP對前列腺癌細胞LNCaP、DU145增殖的抑制率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明HSQAAVP在被131I標記后，原有肽的生物學活性并未發(fā)生改變。綠色熒光素FITC通過與小分子肽HSQAAVP連接，特異性的和前列腺癌細胞結(jié)合，被細胞攝取。激光共聚焦（Confocal）顯微鏡下FITC-HSQA

6、AVP與LNCaP、DU145兩種前列腺癌細胞在37℃孵育24 h后,在綠色熒光通道下均呈綠色強熒光顯色。細胞攝取綠色熒光的能力反應(yīng)小分子多肽HSQAAVP和兩種細胞的親和力，兩者呈正相關(guān)。說明對雄激素激素敏感的LNCaP細胞和不敏感的DU145細胞均與HSQAAVP有較強的結(jié)合能力。在多肽HSQAAVP和131I-HSQAAVP對人前列腺實質(zhì)腫瘤細胞系LNCaP、DU145增殖抑制實驗中，通過公式計算其抑制率，證實多肽HSQAAVP及

7、131I-HSQAAVP均對人前列腺實質(zhì)腫瘤細胞LNCaP、Du145均有增殖抑制作用。抑制的效果因多肽或131I-HSQAAVP濃度的增加而增加。但兩者間的抑制率無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），即多肽HSQAAVP和131I-HSQAAVP對前兩種前列腺癌細胞系LNCaP、DU145的增殖抑制效果無差異。
　　131I-HSQAAVP對LNCaP細胞及DU145細胞殺傷作用鑒定結(jié)果：倒置顯微鏡下可以看到到凋亡細胞存在。激光共聚焦熒

8、光顯微鏡下，透過紅色通道觀察，凋亡細胞呈團狀或碎塊狀致密紅色強熒光。流式細胞分析結(jié)果顯示131I-HSQAAVP與HSQAAVP都對LNCaP、DU145細胞具有誘導(dǎo)細胞凋亡作用，但131I-HSQAAVP對細胞的殺傷作用均明顯高于HSQAAVP，且凋亡率與加入131I-HSQAAVP放射性活度呈正相關(guān)。
　　結(jié)論：通過氯胺T法將131I標記多肽HSQAAVP簡單高效，新分子探針131I-HSQAAVP的生物活性仍被保留，且未受到