FGFR1信號通路在小鼠骨骼發(fā)育和重建中的作用.pdf

1、成纖維細(xì)胞因子I型受體在骨骼發(fā)育和人類遺傳疾病中具有重要作用。人FGFRl P252A功能增強(qiáng)性點突變引起Pfeiffer綜合征和OD綜合征，主要引起人類顱縫早閉和趾骨發(fā)育異常。FGFR1功能喪失性點突變引起人類Kallmann綜合征，但不直接調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育。FGFR1敲除導(dǎo)致小鼠胚胎期死亡，條件性基因敲除技術(shù)使得研究FGFR1在骨骼發(fā)育中的作用成為可能。已有實驗室利用基因條件性敲除技術(shù)研究FGFRI在小鼠骨骼肢芽發(fā)育中的作用，結(jié)果FGF

2、R1是肢芽發(fā)生、發(fā)育和趾骨圖式發(fā)育所必需，Jacob等的研究結(jié)果表明FGFR1促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞增生，抑制前成骨細(xì)胞增生和成熟成骨細(xì)胞礦化，但FGFR1對出生后骨發(fā)育和重建的影響和分子機(jī)制還不完全清楚，同時FGFR1對出生后骨骼質(zhì)量的影響還未見報道。。 BMP受體ALK3是骨骼發(fā)育和重建過程中的負(fù)性調(diào)節(jié)分子。Mishina實驗室發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞敲除ALK3后，成骨細(xì)胞成骨功能下降，破骨細(xì)胞骨吸收功能受抑制。在骨骼發(fā)育過程中，F(xiàn)GF信號

3、通路和BMP信號通路之間關(guān)系復(fù)雜：BMP和FGF信號相互抑制共同調(diào)控軟骨生成；而在成骨過程中，Warren等發(fā)現(xiàn)FGF信號通路可以通過抑制BMP阻斷分子noggin來調(diào)節(jié)BMP信號通路。Matsushita等最新的研究結(jié)果顯示FGFR3激活性突變可以通過FGF信號依賴的BMP信號通路促進(jìn)成骨。目前，成骨細(xì)胞中BMP信號通路與FGFR1的關(guān)系還不明確。本課題利用fgfr1 CKO小鼠和OC-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠制備fgfr1 OC-CKO小鼠

4、，實現(xiàn)在小鼠成熟成骨細(xì)胞敲除FGFRI，從而研究FGFR1對骨骼發(fā)育、重建、出生后骨骼質(zhì)量的維持和鈣和磷代謝的功能。為研究FGFR1和ALK3信號通路的關(guān)系，本研究利用條件性組成性激活A(yù)LK3轉(zhuǎn)基因小鼠和fgfr OC-CKO小鼠交配研究BMP信號通路和FGFR1信號通路在成骨細(xì)胞中的作用。 本課題包括以下兩部分：1.探討FGFR1對骨骼發(fā)育和骨骼重建的影響及其分子機(jī)制；2.激活fgfrl OC-CKO小鼠成骨細(xì)胞中ALK3來研

5、究FGFRI和ALK3信號通路的關(guān)系。 主要實驗內(nèi)容和方法如下： 第一部分 FGFR1信號通路在小鼠骨骼發(fā)育和重建中的作用及其分子機(jī)制 實驗動物：成熟成骨細(xì)胞特異性fgfr1敲除小鼠；對照小鼠。 實驗方法： (一)體內(nèi)實驗 1.fgfrl OC-CKO小鼠整體表型分析 利用X光攝片和骨密度測定對3月、4月和8月齡fgfrl OC-CKO小鼠和對照小鼠骨骼進(jìn)行整體表型分析。此外，還對

6、3月齡小鼠骨架進(jìn)行茜素紅染色。 2.骨骼生物力學(xué)測定 用Instron力學(xué)測定儀通過3點折斷法檢測3月齡和8月齡小鼠股骨力學(xué)性能。 3.鈣和磷測定 采用Beckman DXC800全自動生化分析儀測定6周、4月和8月齡小鼠血清中鈣和磷含量。用能譜儀測定骨皮質(zhì)中鈣和磷百分含量。 4.使用micro CT對3月齡和8月齡fgfrl OC-CKO小鼠和對照小鼠股骨進(jìn)行掃描 利用Scanco公司M

7、icro CT對3月和8月齡小鼠右側(cè)股骨進(jìn)行掃描。 5.組織形態(tài)學(xué)研究和破骨細(xì)胞功能評價 對3月齡fgfrl OC-CKO小鼠和對照小鼠股骨進(jìn)行病理切片，然后利用HE染色和TRAP染色分別對骨骼形態(tài)學(xué)分析和破骨細(xì)胞功能進(jìn)行檢測；利用掃描電鏡對骨骼及其成骨細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。 6.骨組織中類骨質(zhì)、鈣和骨形成率檢測 3月齡小鼠股骨樹脂包埋后行硬組織切片，然后采用Von Kossa染色檢測骨骼中類骨質(zhì)、鈣鹽，熒光

8、顯微鏡直接觀察鈣黃綠素和四環(huán)素標(biāo)記的新骨形成，并測定計算骨沉積率。 (二)體外實驗 1.成骨細(xì)胞增生、凋亡和礦化檢測 新生小鼠顱骨來源的成骨細(xì)胞培養(yǎng)3天后計數(shù)檢測成骨細(xì)胞增生；誘導(dǎo)礦化l周后用TUNEL法進(jìn)行凋亡檢測；誘導(dǎo)礦化3周后行礦化能力檢測。 2.成骨細(xì)胞中與分化和成骨相關(guān)功能基因的轉(zhuǎn)錄水平檢測 顱骨成骨細(xì)胞誘導(dǎo)礦化2周，提取成骨細(xì)胞總RNA，然后利用real time PCR檢測 oste

9、ocalcin、osteopontin、cbfal，noggin、bmp4、bmprla矛口fgfr2的轉(zhuǎn)錄水平。 3.成骨細(xì)胞中與分化和成骨相關(guān)功能基因的蛋白水平檢測 新生小鼠顱骨來源成骨細(xì)胞誘導(dǎo)礦化2周，提取細(xì)胞總蛋白；利用western blot檢測phospho-p38、phospho-ERK、ERK、phospho-SAPK/JNK、p85、ALK3和內(nèi)參β-actin。 第二部分激活成熟成骨細(xì)胞中AL

10、K3可恢復(fù)fgfrl OC-CKO小鼠部分骨骼異常表型 實驗動物：成熟成骨細(xì)胞中特異性敲除fgfrl并激活A(yù)LK3小鼠；fgfrlOC CKO小鼠和對照小鼠。 實驗方法： 實驗方法同于第一部分。 主要實驗結(jié)果： 一、fgfrlOC-CKO小鼠骨量增加 X光片和BMD測定結(jié)果顯示8月齡fgfrlOC-CKO小鼠長骨、顱骨和椎骨等的骨量顯著高于對照小鼠，8月齡fgfrlOC-CKO小鼠脛骨和

11、股骨BMD顯著高于對照小鼠。股骨microCT數(shù)據(jù)顯示：和對照小鼠相比，3月和8月齡fgfrlOC-CKO小鼠股骨骨干單位體積骨密度顯著降低；8月齡fgfrlOC-CKO小鼠骨小梁顯著增加，骨皮質(zhì)厚度和BV/TV極顯著增高；3月齡fgfrlOC-CKO小鼠骨皮質(zhì)厚度無顯著改變，骨小梁多于對照小鼠。HE染色結(jié)果顯示fgfrlOC-CKO小鼠骨細(xì)胞數(shù)量極顯著減少，骨皮質(zhì)小孔隙顯著增加。鈣黃綠素和四環(huán)素標(biāo)記新骨形成結(jié)果表明：fgfrlOC-C

12、KO小鼠骨形成率顯著增加。體外成骨細(xì)胞礦化實驗結(jié)果顯示fgfrlOC-CKO小鼠成骨細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生礦物含量顯著高于對照小鼠。 二、FGFR1經(jīng)ALK3信號通路調(diào)節(jié)骨骼質(zhì)量 3月齡fgfrlOC-CKO小鼠部分出現(xiàn)自發(fā)骨折現(xiàn)象，生物力學(xué)測定結(jié)果顯示fgfrlOC-CKO小鼠股骨楊氏彈性模量和最大載荷均顯著小鼠低于對照小鼠； Von Kossa染色結(jié)果顯示fgfrlOC-CKO小鼠股骨骨皮質(zhì)中央存在大量的紅染區(qū)域，并且著色較對

13、照小鼠淺，提示fgfrlOC-CKO小鼠骨皮質(zhì)鈣和磷含量較低，骨皮質(zhì)中存在較多不成熟的類骨質(zhì)；能譜測定結(jié)果顯示骨皮質(zhì)中單位面積中鈣和磷百分含量顯著低于對照小鼠。激活fgfrlOC-CKO小鼠成骨細(xì)胞中ALK3后，3月齡小鼠股骨和脛骨生物力學(xué)測定結(jié)果顯示fgfrlOC-CKO-caALK3亨小鼠脛骨楊氏彈性模量和最大加載與對照小鼠無顯著差異，股骨最大加載與fgfrlCKO小鼠無顯著差異，但楊氏彈性模量顯著低于fgfrlCKO小鼠，高于fg

14、frlOC-CKO小鼠。 三、FGFR1經(jīng)ALK3調(diào)節(jié)骨骼和血液的鈣和磷代謝 股骨中段骨皮質(zhì)能譜檢測結(jié)果顯示fgfrlCKO小鼠股骨皮質(zhì)中鈣和磷百分含量極顯著低于對照小鼠；4月和8月齡fgfrlOC-CKO小鼠血清鈣和磷含量顯著高于對照小鼠；激活成熟成骨細(xì)胞中ALK3可以恢復(fù)fgfrlOC-CKO小鼠血清鈣和磷水平到正常。 四、激活成熟成骨細(xì)胞中ALK3可以恢復(fù)fgfrlOC-CKO小鼠破骨細(xì)胞活性。 股

15、骨石蠟切片TRAP染色結(jié)果顯示，fgfrlOC-CKO小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量減少，鋪展欠佳；而fgfrlOC-CKO-caALK3小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)均恢復(fù)正常。 五、FGFR1通過抑制PI3K和促進(jìn)MAPK信號通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增生和凋亡 新生小鼠顱骨成骨細(xì)胞增生檢測結(jié)果顯示，敲除FGFR1后成骨細(xì)胞增生加快。TUNEL法檢測誘導(dǎo)一周的fgfrlOC-CKO小鼠和對照小鼠顱骨來源成骨細(xì)胞凋亡結(jié)果：fgfrlOC-CKO小鼠成

16、骨細(xì)胞凋亡顯著減少。誘導(dǎo)一周的fgfrlOC-CKO小鼠成骨細(xì)胞PI3K亞基p85的表達(dá)明顯上調(diào)，MAPK信號通路分子ERK，p38和SAPK/JNK的磷酸化水平下調(diào)。 六、成骨細(xì)胞中FGFR1可以調(diào)節(jié)ALK3信號通路的蛋白表達(dá) 定量PCR結(jié)果顯示fgfrlOC-CKO小鼠顱骨成骨細(xì)胞bmp4和其高親和受體alk3轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)；Western blot結(jié)果顯fgfrlOC-CKO小鼠顱骨成骨細(xì)胞LK3蛋白表達(dá)水平也明顯下

17、調(diào)。 七、FGFR1經(jīng)MAPK信號通路影響骨形成 Western blot結(jié)果顯示fgfrlOC-CKO小鼠顱骨成骨細(xì)胞MAPK信號通路蛋白分子ERK、p38和SAPK/JNK的磷酸化水平均顯著下調(diào)。ERK表達(dá)水平無明顯改變。 主要結(jié)論： 1.FGFR1抑制成骨細(xì)胞礦化和增生，通過PI3K和MAPK信號通路促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。 2.成熟成骨細(xì)胞中FGFR1可能經(jīng)ALK3信號通路調(diào)節(jié)血清鈣和磷代謝，