FGFR3在小鼠成年期骨重建和骨折愈合中的作用和機(jī)制研究.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長因子受體(fibroblast growth factor receptors，F(xiàn)GFRs)屬于受體酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)家族，它們通過與成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GFs)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。FGFs/FGFRs作用廣泛，近年來大量研究發(fā)現(xiàn)FGF信號(hào)與骨骼發(fā)育及疾病也有密切關(guān)系。 骨骼形成主要通過軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨兩

2、種方式來完成。其中骨組織形成的基本過程一致，即間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和密集后分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)，并被包埋其中，成為骨細(xì)胞，繼而類骨質(zhì)鈣化成骨基質(zhì)，最后形成骨組織。在成年期，骨骼正常結(jié)構(gòu)和功能的維持主要通過骨重建(remodeling)來實(shí)現(xiàn)。 FGFR3是FGFRs家族成員之一，它是骨骼生長的負(fù)性調(diào)節(jié)分子。在人體中FGFR3的功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變主要引起軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ACH)、季肋發(fā)育不全(

3、hypochondroplasia，HCH)和致死性骨發(fā)育不全(thanatophoric dysplasia.TD)等三種軟骨發(fā)育不良性疾病。既往對(duì)FGFR3在軟骨發(fā)育中的作用研究較多，但對(duì)其在骨形成，特別是成年期骨重建中的作用和相關(guān)機(jī)制缺乏深入的了解和分析。 人類FGFR3 A391E等功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變可引起囟門早閉，提示FGFR3對(duì)骨形成可能有直接調(diào)節(jié)作用。成年期FGFR3敲除小鼠骨質(zhì)減少，礦化缺陷，進(jìn)一步提示FGFR3可

4、調(diào)節(jié)成骨并能影響成年期骨重建，但具體機(jī)制不明。此外，模擬人類軟骨發(fā)育不全的FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變小鼠除軟骨發(fā)育異常外，出生早期生長板處即有Cbfal、OP和OC等成骨標(biāo)志基因表達(dá)上調(diào)，并伴有骨領(lǐng)提前發(fā)生和骨小梁短少，這時(shí)有關(guān)骨形成的變化和早期軟骨形成障礙還有一定的聯(lián)系，但其成年后骨骼是否還有改變尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。 骨折愈合過程是骨骼局部的再發(fā)育過程，很多調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的分子也都調(diào)節(jié)骨折愈合過程。大量研究表明FGFs參與

5、骨折愈合，而FGFs又通過FGFRs發(fā)揮作用。如前所述，F(xiàn)GFR3是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)骨骼發(fā)育的分子，提示它可能參與調(diào)節(jié)骨折愈合過程，但它對(duì)骨折愈合的具體作用和機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。 據(jù)此，本課題利用野生型和FGFR3功能增強(qiáng)型點(diǎn)突變(FGFR3G369C/+)小鼠(模擬人ACH疾病)，從影響骨重建和骨折愈合的多種因素入手，探討了FGFR3在成年期骨重建和骨折愈合中的作用和機(jī)制。 主要實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分：FGFR3在

6、小鼠成年期骨重建中的作用和機(jī)制研究 1、利用X線攝片、雙能骨密度計(jì)和Micro CT觀察成年小鼠股骨骨密度及骨組織結(jié)構(gòu)的變化。用三點(diǎn)折斷法檢測其生物力學(xué)特性。 2、通過HE、Masson三色染色和鈣綠素雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠脛骨骨小梁的結(jié)構(gòu)及礦化情況。測定血清鈣磷含量，了解體內(nèi)鈣磷代謝是否與骨骼礦化有關(guān)。定量PCR檢測成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因OC、OP和成骨相關(guān)基因FGFRI、FGFR2和BMPRIA的表達(dá)。 3、小鼠骨髓

7、基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)，測定生長曲線并進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。通過堿性磷酸酶、茜素紅染色觀察，結(jié)合成骨相關(guān)基因的表達(dá)，觀察成骨分化和礦化情況，并用Western Blot檢測其Erkl/2磷酸化水平。 4、通過TRAP染色觀察脛骨破骨細(xì)胞形成情況，定量PCR檢測破骨細(xì)胞相關(guān)基因TRAP、Ctsk和MMP9的表達(dá)變化。 5、體外進(jìn)行破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化，通過TRAP染色、骨吸收實(shí)驗(yàn)和破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的檢測，研究破骨細(xì)胞的分化及骨吸收功能。

8、Western Blot檢測破骨細(xì)胞中Erkl/2磷酸化水平。 第二部分：FGFR3在小鼠骨折愈合中的作用和機(jī)制研究 1、用原位雜交方法檢測FGFR3 mRNA在骨折愈合各階段骨痂中的表達(dá)。 2、利用X線攝片和藏紅固綠染色觀察骨折愈合情況。生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測骨折21天后脛骨的機(jī)械性能。 3、利用原位雜交和藏紅固綠染色，結(jié)合骨痂中軟骨細(xì)胞分化相關(guān)基因COL2AI、COLIOA1、IHH和SOX9的mRNA變化

9、觀察軟骨分化情況。通過體外骨髓基質(zhì)細(xì)胞向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證上述在體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。 4、通過骨痂組織TRAP染色，結(jié)合TRAP mRNA表達(dá)檢測，觀察破骨細(xì)胞形成情況。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、FGFR3G369C/+小鼠成年期骨量減少，骨重建異常 1、FGFR3G369a+小鼠成年后骨量減少，骨皮質(zhì)生物力學(xué)性能改變 2月和4月齡的FGFR3G369C/+小鼠股骨骨密度降低，骨小梁數(shù)量減少，分

10、離度降低；骨皮質(zhì)厚度無明顯改變，但反映其生物力學(xué)特性的最大值彎曲載荷和彈性模量均增加。 2、FGFR3G369C/+小鼠成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)、礦化降低 (1)2月齡FGFR3G369C/+小鼠脛骨骨小梁稀疏。骨小梁表面成骨細(xì)胞胞體增大，伴有類骨質(zhì)增多，礦物質(zhì)沉積率降低，提示該小鼠成骨細(xì)胞雖然分泌基質(zhì)的功能活躍，但胞外基質(zhì)礦化能力可能存在缺陷，而體內(nèi)血清鈣磷含量正常，提示骨骼礦化障礙是由成骨細(xì)胞本身功能異常引起的。骨組織中成骨

11、細(xì)胞分化標(biāo)志基因OP表達(dá)增加；成骨相關(guān)基因FGFR1和BMPRIA表達(dá)上調(diào)，F(xiàn)GFR2表達(dá)下降。 (2) FGFR3G369C/+小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞增生減慢，向成骨細(xì)胞分化過程中堿性磷酸酶表達(dá)增加，鈣結(jié)節(jié)形成減少，成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因Cbfal、OP和OC表達(dá)均顯著上調(diào)，表明成骨細(xì)胞分化增強(qiáng)，礦化降低。此外，F(xiàn)GFR3G369C/+小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞中Erkl/2磷酸化蛋白水平明顯增加，提示FGFR3G369C/+小鼠成骨和礦化能力

12、的改變可能是由Erkl/2信號(hào)途徑活化引起的。 3、FGFR3G369C/+小鼠破骨細(xì)胞分化和骨吸收功能增加 (1) FGFR3G369C/+小鼠脛骨生長板處破骨細(xì)胞數(shù)量增加，骨小梁表面吸收陷窩變深；骨組織中破骨細(xì)胞功能相關(guān)基因TRAP和Ctsk表達(dá)明顯增加，MMP9則無改變。結(jié)果提示FGFR3G369C/+小鼠破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能增加。 (2) FGFR3G369C/+小鼠體外誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成數(shù)量及骨片上

13、吸收陷窩面積都明顯增加，破骨細(xì)胞功能相關(guān)基因TRAP和MMP9表達(dá)顯著上調(diào)，Ctsk表達(dá)沒有改變。破骨細(xì)胞Erkl/2蛋白磷酸化水平升高，提示FGFR3可能通過激活Erkl/2通路促進(jìn)了破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能。 二、FGFR3G369C/+小鼠骨折愈合延遲 1.FGFR3在骨折后7天、14天和21天骨痂的增生、肥大前和肥大軟骨細(xì)胞中都表達(dá)，提示FGFR3可能參與調(diào)節(jié)骨折愈合過程。 2.FGFR3G369C/+小

14、鼠脛骨骨折后21天，骨痂中仍有軟骨殘留，并且其最大值彎曲載荷減少，說明該小鼠骨折愈合延遲，并且骨折后脛骨的機(jī)械性能下降。 3.FGFR3G369C/+小鼠骨痂軟骨細(xì)胞分化降低 (1) FGFR3G369C/+小鼠骨痂處增生軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因COL2A1和肥大軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因COL10A1分別在骨折后3天和7天時(shí)表達(dá)滯后或下降；骨折后10和14天，F(xiàn)GFR3G369C/+小鼠骨痂中肥大軟骨細(xì)胞較少，但增生軟骨細(xì)胞和不成熟的間

15、充質(zhì)細(xì)胞較多；軟骨分化相關(guān)基因SOX9和IHH表達(dá)降低。結(jié)果提示FGFR3G369C/+小鼠骨痂軟骨細(xì)胞分化受到抑制。 (2) FGFR3G369C/+小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向軟骨分化過程中COL2A1和SOX9表達(dá)下降，提示體外軟骨細(xì)胞分化減慢。 4、FGFR3G369C/+小鼠骨痂破骨細(xì)胞形成異常 骨折后10天和14天，F(xiàn)GFR3G369a+小鼠骨痂破骨細(xì)胞形成明顯減少，但骨折后21天破骨細(xì)胞形成增加。 主

16、要結(jié)論： 1、FGFR3功能增強(qiáng)點(diǎn)突變小鼠成年期骨量下降由其成骨作用改變及破骨細(xì)胞功能增強(qiáng)共同引起。 2、FGFR3功能增強(qiáng)抑制骨髓基質(zhì)細(xì)胞增生；促進(jìn)Cbfal表達(dá)，繼而上調(diào)OP和OC表達(dá)水平促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化，抑制礦化。這一作用可能部分是通過激活Erkl/2信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。 3、FGFR3功能增強(qiáng)后可能通過激活破骨細(xì)胞中Erkl/2信號(hào)通路，上調(diào)TRAP和Ctsk表達(dá)水平，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能。