FGFR3在骨骼發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持中的作用與相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、FGFR3基因編碼區(qū)的功能增強(qiáng)型(Gain-of-function)點(diǎn)突變可引起多種人類骨骼遺傳病,包括人類非致死性侏儒最常見的類型--軟骨發(fā)育不全、致死性軟骨發(fā)育不全等。這些軟骨發(fā)育不良性疾病主要影響經(jīng)軟骨內(nèi)成骨過程形成的長骨。除部分患者除可通過外科手術(shù)進(jìn)行部分延長肢體外,目前尚無有效的治療方法。
　　FGFR3是軟骨發(fā)育的負(fù)性調(diào)節(jié)分子,影響軟骨細(xì)胞的增殖活性和分化。Chen等發(fā)現(xiàn),FGFR3信號(hào)通過STAT1/p21抑制軟骨細(xì)

2、胞增殖,通過Ihh抑制軟骨細(xì)胞分化。表達(dá)FGFR3ACH(FGFR3G380R)和TDII(FGFR3K650E)突變可導(dǎo)致ATDC5細(xì)胞凋亡增加,而給予PTHrP處理后這種凋亡增加可緩解。PTH1-34抑制FGFR3突變所致的凋亡增加,增加突變所致的生長受抑。PTH1-34能否在體水平上緩解FGFR3功能增強(qiáng)所引起的軟骨發(fā)育不全及其可能的作用機(jī)制有待于研究。
　　FGFR3除影響骨骼發(fā)育外,還參與椎間盤穩(wěn)態(tài)維持。鑒于其在關(guān)節(jié)軟骨

3、中促合成代謝,保護(hù)軟骨基質(zhì)免于降低的作用及終板、關(guān)節(jié)軟骨組成的相似性,我們提出FGFR3可能參與軟骨終板穩(wěn)態(tài)維持,并通過模式小鼠進(jìn)行研究。
　　骨骼遺傳疾病致病基因的發(fā)現(xiàn)不僅有利于相關(guān)遺傳病與基因功能的研究,還極大地促進(jìn)了對(duì)骨骼細(xì)胞發(fā)育分化調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。短指是常見的骨骼發(fā)育不良性疾病,目前尚有較多導(dǎo)致短指的基因尚未克隆。我們通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染結(jié)合報(bào)道基因活性檢測(cè),初步鑒定了一種以E型短指、身材矮小為主要表型的骨骼發(fā)育不良性疾病的突變基

4、因的功能。
　　研究方法:
　　第一部分:
　　1.給藥方式:出生當(dāng)日的WT及ACH小鼠,分別隨機(jī)分為給藥組與對(duì)照組,給藥組給予100μg/(kg·d)PTH1-34皮下注射Fgfr3+/K644Eneo與EIIa-Cre交配,于懷孕E13.5天開始給予100μg/(kg·d)PTH1-34皮下注射至小鼠生產(chǎn),對(duì)照組均給予等量注射用水直至觀察期結(jié)束;
　　2.統(tǒng)計(jì)小鼠存活情況,測(cè)定小鼠生長過程中體重、體長等的變化

5、,采用X線攝影、μCT頭顱局部攝影,觀察小鼠大體形態(tài)及顱底軟骨連接的變化情況;
　　3.通過HE染色觀察次級(jí)骨化中心等生長板發(fā)育情況,μCT觀察小鼠成年期骨結(jié)構(gòu);
　　4.采用PTH1-34間斷處理培養(yǎng)的WT及ACH小鼠胚胎骨組織,觀測(cè)其對(duì)培養(yǎng)骨組織生長的影響;
　　5.PTH處理培養(yǎng)的肢芽Micromass細(xì)胞,觀察其軟骨小結(jié)形成及基質(zhì)分泌;
　　6.利用前軟骨細(xì)胞及293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同形式的FGFR3,研究P

6、TH處理對(duì)相關(guān)分子表達(dá)及活性的影響。
　　第二部分:
　　1.建立軟骨中敲除FGFR3小鼠及成年期軟骨中敲除FGFR3的小鼠模型;
　　2.利用X線、μCT及組織切片阿爾新藍(lán)-蘇木素-伊紅染色觀察椎間盤;
　　3.免疫組化檢測(cè)小鼠椎間盤軟骨細(xì)胞基質(zhì)Col2、Col10,軟骨基質(zhì)酶類MMP13、ADMTS,成骨標(biāo)志OC及血管標(biāo)記VEGF、CD31表達(dá);
　　4.定量檢測(cè)椎間盤組織中相關(guān)基因Col2、Col10

7、、Aggrecan、OC、MMP13、ADMTS的表達(dá)變化。
　　第三部分:
　　1.通過前軟骨細(xì)胞ATDC5轉(zhuǎn)染不同形式的X,MTT及細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖,阿爾新藍(lán)染色基質(zhì)分泌,定量檢測(cè)Col2、Col10、Aggrecan、PTHrP及FGFR3等軟骨分化相關(guān)基因表達(dá);
　　2.構(gòu)建Pthlh不同長度報(bào)道基因,利用雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)研究突變X對(duì)Pthlh轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　一、PT

8、H1-34可治療FGFR3功能增強(qiáng)的軟骨發(fā)育不良
　　1.PTH處理可使TDII小鼠存活,但存活的TDII小鼠仍然存在骨骼發(fā)育障礙:個(gè)體短小、骨骼短縮彎曲、生長板結(jié)構(gòu)紊亂、顱底軟骨連接提前閉合、骨小梁減少等;
　　2.PTH處理促進(jìn)ACH小鼠大體生長,緩解其頭顱圓鈍,促進(jìn)其次級(jí)骨化中心出現(xiàn),以及改善其成年期骨量減少;
　　3.PTH可促進(jìn)培養(yǎng)骨組織生長,并主要通過促進(jìn)軟骨生長發(fā)揮作用;
　　4.PTH可促進(jìn)ACH

9、小鼠肢芽Micromass軟骨小結(jié)形成及基質(zhì)分泌;
　　5.PTH對(duì)ACH軟骨的影響可能通過降低FGFR3的表達(dá)及活性,促進(jìn)PTHrP表達(dá)來完成。
　　二、FGFR3參與終板/椎間盤穩(wěn)態(tài)維持
　　1.ACH小鼠終板自發(fā)性退變----骨化較WT小鼠延遲;
　　2.全身及軟骨內(nèi)敲除FGFR3小鼠脊柱側(cè)彎、骨量減少、椎體生長板及終板結(jié)構(gòu)紊亂,椎體/椎間盤發(fā)退變較野生小鼠提前:骨贅生成;
　　3.成年期軟骨細(xì)胞敲除

10、FGFR3后小鼠椎間盤終板出現(xiàn)退變的早期表現(xiàn):軟骨基質(zhì)丟失,終板出現(xiàn)類似異位成骨的骨樣組織,成骨標(biāo)記OC、軟骨基質(zhì)降解酶MMP13表達(dá)增加。
　　三、突變X基因抑制軟骨發(fā)育及Pthlh轉(zhuǎn)錄活性
　　1.突變X基因抑制軟骨增殖、基質(zhì)分泌及降低軟骨分化相關(guān)基因Col2、Col10、Aggrecan、PTHrP及FGFR3表達(dá);
　　2.突變X可能通過pthlh基因啟動(dòng)子上的AP1結(jié)合位點(diǎn)抑制其轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)論:<