Hippo信號通路在小鼠牙齒中的作用研究.pdf

1、背景和目的：
　　 Hippo信號通路中的抑癌基因Mst1/2-Sav1和Lats1/2-Mob的激活會導(dǎo)致YAP/TAZ的磷酸化，并促使其在胞漿中降解。YAP/TAZ也受細(xì)胞與細(xì)胞接觸的影響，這種影響主要是靠通過緊密連接和粘附來發(fā)揮作用的。抑制Hippo信號通路會導(dǎo)致YAP/TAZ活化，并導(dǎo)致其核轉(zhuǎn)移。一旦與細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)TEAD1-4，p53等結(jié)合就會啟動他們的高表達(dá)。先前研究顯示Hippo信號通路，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡來調(diào)

2、控組織器官的大小。Yap激活后可逆性增加肝臟大小超過4倍，但是持續(xù)性過表達(dá)則會引起肝癌，Yap在心肌細(xì)胞中的過表達(dá)會導(dǎo)致心肌細(xì)胞增生使的相鄰腔隙閉塞從而導(dǎo)致心肌增生。Yap在小鼠胚胎干細(xì)胞分化過程中是被抑制甚至是失活的，但是在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS)的過程中是被激活而且高表達(dá)。在小鼠胚胎干細(xì)胞的發(fā)育過程中將Yap敲除會導(dǎo)致它多能型的喪失，相反如果Yap過表達(dá)則會導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞分化功能的受阻。此外，Yap也調(diào)節(jié)組織特異性祖細(xì)胞的發(fā)育，小腸

3、上皮中Yap的表達(dá)一般被限制在正常小鼠小腸上皮祖細(xì)胞，Yap的基因的過表達(dá)，在小鼠腸道導(dǎo)致的細(xì)胞祖細(xì)胞高度聚集且分化能力降低;而Yap在小鼠皮膚中的過表達(dá)會導(dǎo)致在小鼠皮膚表皮基底細(xì)胞巢擴(kuò)大，并抑制其終末分化。在哺乳動物中，Yap也顯示出它在組織再生中發(fā)揮著重要的作用。在野生型小鼠Yap僅能在小腸隱窩上皮細(xì)胞中檢測到，但是在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)腸道損傷明顯誘導(dǎo)Yap的表達(dá)，如果Yap缺失，腸道損傷再生受到阻礙。同時在Yap基因敲除小鼠肝發(fā)育中

4、不僅導(dǎo)致肝細(xì)胞的凋亡也導(dǎo)致了在膽管的發(fā)育中出現(xiàn)障礙。
　　 小鼠切牙是不斷生長的，這種現(xiàn)象持續(xù)存在于它的整個生命周期，這種現(xiàn)象的發(fā)生是受存在于小鼠唇側(cè)上皮干細(xì)胞支持的。牙源性上皮干細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)釉上皮，星狀網(wǎng)，中間層和外釉質(zhì)上皮層，并且能夠分化成釉細(xì)胞。唇側(cè)頸環(huán)上皮干細(xì)胞的增殖和遷移，分化為成釉細(xì)胞并沿唇面逐步礦化成為牙釉質(zhì)。相比之下，舌側(cè)頸環(huán)包含較少增殖的干細(xì)胞，在切牙齒的舌面則缺乏牙釉質(zhì)的形成。
　　 Pitx2基因被證

5、明在小鼠早期牙胚的發(fā)育中起到很重要的作用，Pitx2基因編碼三種異構(gòu)體，小鼠Pitx2a，Pitx2b和Pitx2c和第四種Pitx2亞型Pitx2d，這種亞型僅存在于人類中Pitx2a，Pitx2b和Pitx2c亞型在牙源性上皮中表達(dá)，而且持續(xù)表達(dá)與在牙齒上皮結(jié)構(gòu)。因此可以利用Pitx2作為驅(qū)動子來產(chǎn)生特定細(xì)胞種類或特定區(qū)域內(nèi)的基因敲除，或者是基因的過表達(dá)。
　　 本研究主要通過采用熒光示蹤來展示Pitx2-Cre基因在小鼠切

6、牙及磨牙發(fā)育過程中的蕾狀期，帽狀期，鐘狀期，分泌期的表達(dá)，同時檢測Yap基因在小鼠牙齒發(fā)育過程中時空特異性表達(dá)模式，并且在牙源性上皮特定敲除和敲入Yap基因，觀察其對小鼠牙齒發(fā)育的影響。
　　 方法：
　　 Pitx2-Cre;TomatoAi14;C57不同時期胚胎的獲取后，冰凍切片后用熒光示蹤方法檢測Pitx2-Cre基因在小鼠牙齒發(fā)育不同階段表達(dá)，同時用原位雜交技術(shù)檢測Yap基因在小鼠牙齒發(fā)育過程中時空特異性表達(dá)。

7、利用Pitx2-Cre在牙源性上皮中表達(dá)模式，構(gòu)建Yap的條件敲除小鼠，以及轉(zhuǎn)基因小鼠，檢測Yap基因在牙源性上皮細(xì)胞及牙齒發(fā)育中的作用。
　　 結(jié)果：
　　 Part1
　　 1.Pitx2-Cre基因可從帽狀期，鐘狀期，分泌期均可見到Pitx2-Cre基因在磨牙與切牙的內(nèi)釉上皮，外釉上皮，以及cervicalloop區(qū)域高表達(dá)。
　　 2.在蕾狀期，帽狀期，鐘狀期，分泌期的磨牙及切牙中均可見到Y(jié)ap的

8、表達(dá)，其主要分布區(qū)域在上皮細(xì)胞層，Yap基因可在頰側(cè)與舌側(cè)的頸環(huán)區(qū)域表達(dá)，在間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá)較弱。
　　 Part2
　　 1.Pitx2-Cre;Yapflox/flox與正常小鼠比較其體型沒有改變，顏面部發(fā)育正常，未見牙列缺損，但是牙齒的色澤茭白，而且牙齒形態(tài)較小，左右不對稱，表面光滑度較差。磨牙區(qū)牙釉質(zhì)呈現(xiàn)低密度影像，咬合面牙釉質(zhì)缺損嚴(yán)重，牙冠近遠(yuǎn)中面可見牙釉質(zhì)發(fā)育不全不能完整覆蓋近遠(yuǎn)中側(cè)，但牙冠的頰舌面發(fā)育正常，牙

9、齒的外形高點(diǎn)線位置發(fā)生改變，牙根較正常組粗大，牙周膜不明顯;切牙舌側(cè)出現(xiàn)高密度影像，即異位表達(dá)的牙釉質(zhì)，同時頰側(cè)的牙釉質(zhì)覆蓋范圍減少，僅在靠近中線處有少量牙釉質(zhì)覆蓋。
　　 2.掃描電鏡顯示切牙形態(tài)小，切牙切端呈現(xiàn)切割狀，牙釉質(zhì)基本結(jié)構(gòu)釉柱較少，即使存在少量的釉柱也被包裹在無定型的基質(zhì)中間。磨牙顯示萌出時間晚于正常，而且牙尖發(fā)育異常，在牙尖周圍可見大量散落的小的釉珠。
　　 3.HE染色顯示，在E14.5天下頜第一磨牙區(qū)

10、未見明顯異常，E16.5/E18.5磨牙形態(tài)減小，牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常，內(nèi)釉上皮層，外釉上皮層斷裂，在星網(wǎng)狀層顯示有較大血管的形成，并且顯示向牙乳頭層方向侵入生長;E16.5/E18.5天切牙cervicalloop減小，牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常。
　　 4.Insitu顯示Pitx2-Cre;Yapflox/flox基因敲除小鼠E18.5cervicalloop區(qū)域出現(xiàn)Fgf3與Fgf9的表達(dá);Msx1的表達(dá)降低;

11、Amelogenin表達(dá)在切牙舌側(cè)出現(xiàn)表達(dá)證明舌側(cè)異位牙釉質(zhì)的出現(xiàn);Dspp的表達(dá)在E18.5的切牙舌側(cè)的成牙釉質(zhì)細(xì)胞與成牙本質(zhì)細(xì)胞，而正常小鼠僅在切牙舌側(cè)成牙本質(zhì)細(xì)胞表達(dá);p21的表達(dá)在未見明顯異常表現(xiàn);MMP20/Follistatin的表達(dá)也出現(xiàn)在舌側(cè)成牙釉質(zhì)細(xì)胞層，F(xiàn)ollistatin在唇側(cè)成釉細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)。
　　 Part3
　　 1.Pitx2-Cre;YAPTg轉(zhuǎn)基因小鼠體型變小，可見牙列缺損。磨牙區(qū)牙釉

12、質(zhì)呈現(xiàn)低密度影像，牙根較正常組短，牙周膜不明顯，牙冠近遠(yuǎn)中面及頰舌面未見牙釉質(zhì)覆蓋，但是在牙冠內(nèi)區(qū)域出現(xiàn)環(huán)狀影像;切牙牙釉質(zhì)覆蓋范圍減少，僅在靠近中線處有少量牙釉質(zhì)覆蓋未見異位表達(dá)牙釉質(zhì)。
　　 2.HE染色顯示，在E14.5/E16.5/E18.5磨牙牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常，成釉器外釉上皮層，星網(wǎng)狀層發(fā)育未見明顯異常，E16.5內(nèi)釉上皮層輕微增生;E18.5內(nèi)釉上皮層向星網(wǎng)狀層方向增生，cervicalloop區(qū)域膨大。

13、在E16.5/E18.5牙乳頭及牙囊未見明顯發(fā)育異常，E16.5切牙cervicalloop增加，在E18.5天切牙cervicalloop膨大明顯，在外釉上皮層出現(xiàn)增生。
　　 3.Brdu染色顯示，在E16.5/E18.5天下頜第一磨牙牙乳頭及牙囊未見明顯異常，成釉器外釉上皮層/cervicalloop內(nèi)釉上皮區(qū)域增值未見明顯異常;在E16.5/E18.5天下頜切牙牙乳頭及牙囊，成釉器內(nèi)釉上皮層未見明顯異常，E18.5cer

14、vicalloop區(qū)域外釉上皮區(qū)域增值顯著增多，而E16.5不明顯。
　　 4.Fgf3在E14.5未見明顯改變E16.5下頜第一磨牙的表達(dá)稍微降低，在E18.5cervicalloop區(qū)域不表達(dá)，在靠近c(diǎn)ervicalloop區(qū)域的牙乳頭區(qū)域表達(dá)降低;Fgf9的表達(dá)增強(qiáng)并且在舌側(cè)cervicalloop表達(dá);Msx1的表達(dá)在E16.5，E18.5下頜第一磨牙及切牙cervicalloop表達(dá)強(qiáng)度差異改變不大，但是表達(dá)區(qū)域也發(fā)生

15、改變，在上皮層可見到表達(dá);Amelogenin表達(dá)強(qiáng)度差異不明顯;Dspp的表達(dá)在E18.5的切牙區(qū)前段表達(dá)增加;p21的表達(dá)在E18.5的切牙區(qū)頂端表達(dá)增強(qiáng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Yap在正常小鼠牙齒的發(fā)育中是持續(xù)表達(dá)的，Yap的表達(dá)位置與強(qiáng)度具有時空特異性;Pitx2-Cre能夠驅(qū)動特定基因在牙源性上皮細(xì)胞中表達(dá)。
　　 2.Pitx2-Cre介導(dǎo)的牙源性上皮細(xì)胞特定敲除Yap后，在牙齒發(fā)育鐘狀期開始出現(xiàn)

16、內(nèi)釉上皮層的斷裂，在成體小鼠會顯著促進(jìn)切牙舌側(cè)成釉細(xì)胞的分化，出現(xiàn)異位牙釉質(zhì);抑制唇側(cè)頸環(huán)干細(xì)胞增殖，導(dǎo)致唇側(cè)牙釉質(zhì)發(fā)育障礙;切牙頰側(cè)頸環(huán)減小;磨牙體積減小，近遠(yuǎn)中側(cè)牙釉質(zhì)發(fā)育障礙;牙齒萌出時間延緩。
　　 3.Pitx2-Cre介導(dǎo)的牙源性上皮細(xì)胞過表達(dá)Yap后，在牙齒發(fā)育鐘狀期開始出現(xiàn)內(nèi)釉上皮層增殖增多，頸環(huán)膨大，在成體小鼠會顯著抑制成釉細(xì)胞的分化，導(dǎo)致切牙及磨牙牙釉質(zhì)大面積缺失，牙齒的形態(tài)減小，伴隨牙列缺損;切牙頰側(cè)頸環(huán)增