谷氨酸信號通路在表皮中的作用研究.pdf

1、目的：探討谷氨酸信號通路在表皮中的作用機(jī)制。
　　 方法：
　　 1．原代培養(yǎng)并純化黑素細(xì)胞(Melanocyte，MC)；倒置顯微鏡觀察MC細(xì)胞形態(tài)；免疫熒光顯微鏡觀察MC中離子型谷氨酸受體N-甲基-D-天冬氨酸受體1(NMDAR1)和N-甲基-D-天冬氨酸受體2A(NMDAR2A)的細(xì)胞內(nèi)分布；共聚焦顯微鏡觀察谷氨酸信號通路對MC胞內(nèi)鈣離子濃度的影響以及MC內(nèi)β-tubulin的分布。
　　 2．原代培養(yǎng)并純

2、化角質(zhì)形成細(xì)胞(Keratinocyte，KC);倒置顯微鏡觀察KC細(xì)胞形態(tài)；免疫熒光顯微鏡觀察KC中NMDAR1和NMDAR2A的細(xì)胞內(nèi)分布；共聚焦顯微鏡觀察谷氨酸信號通路對KC胞內(nèi)鈣離子濃度的影響以及KC內(nèi)β-tubulin的分布；流式細(xì)胞儀測定NMDA受體拮抗劑MK-801對KC凋亡的作用。
　　 3．建立MC和KC共培養(yǎng)體系；倒置顯微鏡觀察二者共培養(yǎng)的形態(tài)；掃描電鏡觀察MK-801作用下二者相互作用的形態(tài)學(xué)改變；酶標(biāo)儀測

3、定由MC向KC轉(zhuǎn)運(yùn)的黑素顆粒OD475值。
　　 結(jié)果：
　　 1．倒置顯微鏡下MC呈樹突樣生長；免疫熒光顯微鏡下顯示黑素細(xì)胞中的NMDAR1和NMDAR2A均主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)，而NMDA2A在樹突分叉處表達(dá)更多；100μM濃度的NMDA使黑素細(xì)胞瞬時鈣離子濃度升高，100μM濃度MK-801使其瞬時鈣離子濃度降低，MK-801事先作用于MC5min或1h阻斷了NMDA受體后，NMDA均不能再次誘發(fā)瞬時鈣離子濃度升高；

4、共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)MK-801作用24小時后導(dǎo)致黑素細(xì)胞樹突回縮，胞內(nèi)β-tubulin重新分布聚集于核周。
　　 2．倒置顯微鏡下KC為鋪路石樣生長；免疫熒光顯微鏡下顯示角質(zhì)細(xì)胞中的NMDAR1和NMDAR2A均主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)；100μM濃度的NMDA使角質(zhì)細(xì)胞瞬時鈣離子濃度升高；流式細(xì)胞儀顯示100μM的MK-801孵育角質(zhì)細(xì)胞48h后凋亡細(xì)胞比例較對照組無明顯差異；共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn)MK-801作用24小時后導(dǎo)致角質(zhì)

5、細(xì)胞核周的β-tubulin密度增大。
　　 3．掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)100μM MK-801作用于共培養(yǎng)體系48h后，MC樹突數(shù)量無明顯變化，KC之間相互連接的絲狀偽足的數(shù)量、KC表面的絲狀偽足數(shù)量以及MC-KC間的絲狀偽足減少；通過酶標(biāo)儀測定共培養(yǎng)48h后，使用100μM MK-801孵育組與正常共培養(yǎng)的未處理組相比較，KC中的黑素顆粒OD475值明顯降低，提示從MC向KC轉(zhuǎn)運(yùn)的黑素小體數(shù)量減少。
　　 結(jié)論：
　

6、　 1.MC內(nèi)有NMDAR1及NMDAR2A的表達(dá)。
　　 2．谷氨酸信號通路可影響MC胞內(nèi)鈣離子濃度。
　　 3．谷氨酸信號通路通過作用于MC內(nèi)β-tubulin而影響MC絲狀偽足的數(shù)量，而后者是該通路影響MC和KC間黑素轉(zhuǎn)運(yùn)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　 4.KC內(nèi)有NMDAR1及NMDAR2A的表達(dá)。
　　 5．谷氨酸信號通路影響KC細(xì)胞形態(tài)及其胞內(nèi)鈣離子濃度，而該形態(tài)學(xué)改變與細(xì)胞凋亡無關(guān)；同時影響KC中β-