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文檔簡介
1、本研究針對谷氨酸檢測所存在的成本高昂、特異性低、穩(wěn)定性差等問題,開發(fā)了一種利用微生物表面展示技術(shù)進(jìn)行全細(xì)胞生物催化檢測谷氨酸含量的方法,該方法具有操作簡單、成本低廉、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點。同時該研究通過構(gòu)建不同的表面展示系統(tǒng)探究了his-tag標(biāo)簽、不同表達(dá)載體和表達(dá)菌株對蛋白可溶性表面展示的影響,為實現(xiàn)表面展示技術(shù)的實際應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。外源蛋白和錨定蛋白的匹配是能否成功構(gòu)建表面展示系統(tǒng)的重要因素,本研究首先以來自于Bac
2、illus subtilis的谷氨酸脫氫酶基因為目的基因,以來自于Pseudomona borealis的冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域為錨定蛋白構(gòu)建了表達(dá)載體。結(jié)果證明融合蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中以包涵體形式表達(dá),說明目的蛋白沒有成功表面展示在大腸桿菌細(xì)胞表面。本研究接著以來自于菌株Thermococcus waiotapuensis的谷氨酸脫氫酶基因為目的基因,以冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域為錨定蛋白構(gòu)建了表達(dá)載體,結(jié)果表明谷氨酸脫氫酶成功展示在大腸桿菌細(xì)胞
3、表面,說明冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域?qū)碜杂谠摼墓劝彼崦摎涿赣泻芎玫姆置谡故竟δ堋_@是谷氨酸脫氫酶首次在大腸桿菌表面展示,為微生物表面展示技術(shù)應(yīng)用于生物傳感器、食品檢測、醫(yī)藥行業(yè)等領(lǐng)域提供了理論研究基礎(chǔ)和實際應(yīng)用生物材料。本研究主要獲得了以下幾個方面的研究成果:
1.B.subtilis中谷氨酸脫氫酶表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建
首先以來自于B.subtilis的谷氨酸脫氫酶基因為目的基因,以冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域為錨定蛋白,分別構(gòu)建了
4、表達(dá)載體pET-Inp-gldh、pET-Inp-gldhT和pACY-Inp-gldh,將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)菌株。通過SDS-PAGE和酶活測定對蛋白表達(dá)進(jìn)行了定位分析,發(fā)現(xiàn)融合蛋白在大腸桿菌細(xì)胞中以無活性的包涵體形式表達(dá),說明來源于該菌的谷氨酸脫氫酶沒有展示到到大腸桿菌細(xì)胞表面。
該部分研究同時表明:來自于B.subtilis的谷氨酸脫氫酶基因的表達(dá)在有無his-tag標(biāo)簽表達(dá)的情況下均以包涵體形式被表達(dá);表達(dá)載體pET2
5、8a(+)和pACYCDuet-1對來自于該菌的谷氨酸脫氫酶的表達(dá)效果相同,都以包涵體形式表達(dá);質(zhì)粒pET-Inp-gldh和pACY-Inp-gldh轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株Ecoli BL21(DE3)、E.coli transB(DE3)、E.coli transetta(DE3)、E.coli BL21(DE3) plys后,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)生的融合蛋白都為包涵體,說明以上各表達(dá)菌株對來自于該菌的谷氨酸脫氫酶表達(dá)效果一致。
2.T.w
6、aiotapuensis中谷氨酸脫氫酶表面展示系統(tǒng)的構(gòu)建
以T.waiotapuensis中編碼谷氨酸脫氫酶的基因為目的基因,以冰核蛋白N端結(jié)構(gòu)域為錨定蛋白構(gòu)建了表達(dá)載體pTInaPb-N-Gldh,將其轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)中,誘導(dǎo)表達(dá)后的菌株進(jìn)行SDS-PAGE電泳和酶活測定分析,發(fā)現(xiàn)來自于該菌的谷氨酸脫氫酶成功展示在大腸桿菌細(xì)胞表面。
本研究中測得谷氨酸脫氫酶展示菌株的全細(xì)胞酶活為3.12 U/O
7、D600,外膜組分酶活占全細(xì)胞酶活的90%;其反應(yīng)的最適溫度為70℃,最適pH為9.0。該融合蛋白在4℃條件下放置一個月之后,幾乎能保持100%的活性,具有很好的酶活穩(wěn)定性。過渡金屬離子能夠不同程度的抑制酶活,而常見金屬離子和陰離子對酶活幾乎沒有影響。該表面展示的谷氨酸脫氫酶能夠特異性催化L-谷氨酸,優(yōu)于目前已報道的其它谷氨酸脫氫酶;并且以NADP+為專一性輔酶,反應(yīng)產(chǎn)生的NADPH能夠在340 nm處進(jìn)行光譜測定檢測得到。本研究以表面
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