RNAi抑制大鼠睪丸支持細胞uPA基因表達的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述:
　　第一部分 大鼠睪丸支持細胞原代培養(yǎng)和鑒定
　　目的:培養(yǎng)高純度的大鼠睪丸支持細胞,通過多種方法對培養(yǎng)細胞進行鑒定。
　　方法:選用18~22天齡SD雄性大鼠,處死后立即取睪丸組織,依次用0.25％的胰蛋白酶、0.1%透明質(zhì)酸酶和0.1%的膠原酶消化分離支持細胞,置于32℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),48h后用20mmol/L Tris-HCl低滲處理培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)1周后應(yīng)用吖啶橙染色、F

2、eulgen染色及免疫組化法檢測FasL鑒定分離培養(yǎng)的支持細胞。
　　結(jié)果:培養(yǎng)1周后所獲得的睪丸支持細胞純度達95%以上。分離培養(yǎng)的支持細胞FasL表達陽性,其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與用其它方法鑒定為支持細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征一致。
　　結(jié)論:本實驗培養(yǎng)方法可獲得高純度的睪丸支持細胞,可以很好地應(yīng)用于后續(xù)的實驗研究。
　　第二部分 RNAi抑制大鼠睪丸支持細胞uPA基因表達
　　實驗一：siRNA轉(zhuǎn)染大鼠睪丸支持細胞條件優(yōu)化

3、
　　目的:觀察化學合成siRNA阻斷大鼠睪丸支持細胞內(nèi)源性基因表達的可行性,并優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。
　　方法:按已建立方法分離、培養(yǎng)支持細胞,應(yīng)用化學合成的不同濃度針對GAPDH的siRNA在陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染原代睪丸支持細胞。RT-PCR檢測大鼠支持細胞中GAPDH mRNA水平的變化,MTT法檢測支持細胞的活率。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染終濃度為150nmol/L的siRNA能特異性有效

4、的阻斷GAPDH基因的表達,細胞毒性隨著濃度的提高而增強,終濃度為200nmol/L的siRNA對細胞有明顯毒性。
　　結(jié)論:siRNA能在大鼠睪丸支持細胞內(nèi)啟動RNA干擾,150nmol/L的siRNA能特異有效地阻斷內(nèi)源基因并保持較高的細胞活性。
　　實驗二：siRNA抑制大鼠睪丸支持細胞uPA基因表達
　　目的:利用化學合成siRNA抑制大鼠睪丸支持細胞uPA基因的表達,并篩選抑制效果最佳的siRNA序列。

5、>　　方法:體外取SD大鼠睪丸,分離、培養(yǎng)支持細胞,應(yīng)用3對針對大鼠uPA基因的siRNA序列(uPA siRNA1、uPA siRNA2、uPA siRNA3)和1對陰性對照siRNA,在陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染原代睪丸支持細胞。RT-PCR檢測大鼠支持細胞中uPA mRNA水平的變化,Westren blot法檢測uPA蛋白表達水平。
　　結(jié)果:uPA siRNA1、uPA siRNA2和u