FSH對(duì)仔豬睪丸支持細(xì)胞GDNF表達(dá)調(diào)節(jié)的研究.pdf

1、本論文以原代培養(yǎng)仔豬睪丸支持細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究了FSH對(duì)GDNF表達(dá)的調(diào)節(jié)。 免疫組化(immunhistochemistry)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在幼齡階段(2-4周齡)，GDNF蛋白主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞區(qū)，而在曲細(xì)精管內(nèi)未見(jiàn)表達(dá)。從第2月齡開(kāi)始，GDNF蛋白在曲細(xì)精管內(nèi)的支持細(xì)胞胞漿出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，呈較低水平表達(dá)。隨著年齡的進(jìn)一步增長(zhǎng)，GDNF在睪丸曲細(xì)精管內(nèi)的表達(dá)也不斷增強(qiáng)，到成年時(shí)GDNF蛋白表達(dá)水平達(dá)最高。RT-PCR結(jié)果顯示

2、，仔豬出生后2周，睪丸中即存在GDNFmRNA的表達(dá)，隨著年齡的增加，GDNFmRNA水平持續(xù)升高，到2月齡和6、18月齡分別與出生2周時(shí)有顯著性(P＜0.05)和極顯著性(P＜0.01)差異，其中第6月齡達(dá)高峰。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GDNF可能直接參與了出生后仔豬睪丸發(fā)育調(diào)節(jié)，并在調(diào)節(jié)精子發(fā)生中起著重要作用。 為了了解FSH對(duì)支持細(xì)胞GDNF蛋白的調(diào)控機(jī)制，我們以原代培養(yǎng)SC為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究了FSH對(duì)SC增殖及其GDNF表達(dá)的影響。

3、結(jié)果顯示：(1)FSH可以延長(zhǎng)SC的體外存活時(shí)間，促進(jìn)SC的體外發(fā)育、貼壁和擴(kuò)展，當(dāng)FSH濃度為50ng/ml。作用48小時(shí)，其作用效果最強(qiáng)，證實(shí)FSH是早期仔豬SC培養(yǎng)時(shí)的必要添加成分。(2)FSH還促進(jìn)了SC增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen，PCNA)的表達(dá)，F(xiàn)SH(50ng/m1)處理細(xì)胞15min，即可檢測(cè)到PCNA；作用時(shí)間達(dá)30min時(shí)，PCNA的表達(dá)達(dá)顯著水平；到2h，PCNA

4、蛋白水平達(dá)到最高，隨后逐漸降低。表明FSH促進(jìn)SC增殖呈時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系。(3)外源性添加FSH可促進(jìn)GDNF蛋白表達(dá)，而且這種促進(jìn)作用具有濃度和時(shí)間依賴(lài)關(guān)系：GDNF蛋白水平隨著FSH濃度增加而升高，當(dāng)FSH濃度為50ng/ml時(shí)，GDNF水平達(dá)到最高，然后逐漸降低；FSH(50ng/m1)作用30min，可顯著促進(jìn)GDNF蛋白的表達(dá);當(dāng)FSH作用1小時(shí)，GDNF蛋白水平達(dá)到最高，隨后逐漸降低。 通過(guò)向體外培養(yǎng)的4周齡的仔豬睪丸

5、支持細(xì)胞中加入信號(hào)通路中蛋白激酶的調(diào)節(jié)因子，研究了FSH對(duì)GDNF蛋白的調(diào)節(jié)作用及信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：(1)FSH(50ng/m1)處理SC，可迅速激活MEK激酶，隨FSH刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，ERK1/2活性逐漸升高(0-2h)；(2)dbcAMP(100μM)同樣能迅速激活MEK激酶，誘導(dǎo)GDNF蛋白、mRNA的表達(dá)；ERK1/2活性的濃度隨dbcAMP刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高(0-2h)，(3)加入ERK1/2的抑制劑U0126和

6、PKA的抑制劑H89，顯著抑制了FSH對(duì)GDNF的激活作用，GDNF蛋白、mRNA和活性明顯下降，表明FSH對(duì)GDNF的誘導(dǎo)依賴(lài)于PKA和MAPK。(4)加入PKA的抑制劑H89(10μM)，明顯抑制了FSH誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化的激活作用，提示FSH對(duì)支持細(xì)胞中ERK1/2的激活是通過(guò)PKA來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此，我們認(rèn)為FSH在誘導(dǎo)GDNF蛋白的表達(dá)過(guò)程中，以下兩條信號(hào)途徑參與了其中的傳遞信息：(1)通過(guò)cAMP—PKA調(diào)節(jié)GDNF基因的

7、表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)支持細(xì)胞GDNF蛋白的表達(dá)：(2)通過(guò)cAMP—PKA，激活ERK級(jí)聯(lián)，ERK級(jí)聯(lián)激活SREBP，促進(jìn)GDNF基因的表達(dá)。 綜上所述，可以得到如下結(jié)論：(1)GDNF在公豬睪丸的支持細(xì)胞中表達(dá)，隨著年齡的增長(zhǎng)，GDNF表達(dá)量增加?？赡芤耘苑置诘男问秸{(diào)節(jié)精子發(fā)生；(2)在體外培養(yǎng)的支持細(xì)胞，F(xiàn)SH可促進(jìn)其增殖以及GDNF的表達(dá)，由于GDNF的表達(dá)早于PCNA，表明FSH可通過(guò)促進(jìn)SC表達(dá)GDNF進(jìn)而促進(jìn)支持細(xì)胞的增值；